子。PCR鉴定的引物序列如下：
[0152] 3、beta胡萝卜素生产和鉴定
[0153] 将验证正确整合的酵母菌株接种于YH)培养基中，培养2-3天后收集，冻干，破壁 后用90%的丙酮对酵母细胞内的类胡萝卜素进行提取，以(6-胡萝卜素（Sigma-Aldrich产 品，产品目录号为C4582-5mG)为标准品，进行HPLC检测分析，根据峰面积得到目的转化子 0-胡萝卜素的相对产量。
[0154] 检测结果如图1所示：样品与beta胡萝卜素标准品的保留时间一致。说明本发明 成功生产得到beta胡萝卜素。
[0155] 实施例3、酵母染色体在生产紫色杆菌素中的应用
[0156] 1、目的片段的合成
[0157] 人工合成序列表中序列18所示的DNA片段，该片段依次由URR1、TEF2启动子、 vioA基因、ADHl终止子、TEF2启动子、vioB基因、ADHl终止子、TEF2启动子、vioC基因、 ADHl终止子、TEF2启动子、vioD基因、ADHl终止子、TEF2启动子、vioE基因、ADHl终止子、 LEU2(筛选标记基因）和URR2组成。所有的启动子、基因、终止子均为无缝连接。
[0158] 2、转化
[0159] 将步骤1合成的序列表中序列18所示的DNA片段转化到实施例1制备的含有重 复重组盒的酵母菌株中，利用酵母同源重组，得到正确整合的酵母菌株。并对其进行PCR鉴 定。其中PCR鉴定的步骤如下：
[0160] 以转化子的基因组DNA为模板，以Primera和Primerb为引物进行PCR扩增， PCR扩增产物为568bp的目的片段的转化子为含有URRl的转化子；以Primerc和Primer d为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为682bp的目的片段的转化子为含有URR1、TEF2启 动子、vioA基因的转化子；以Primere和Primerf为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为 956bp的目的片段的转化子为含有VioA基因、ADHl终止子、TEF2启动子、VioB基因的转化 子；以Primerg和Primerh为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为1052bp的目的片段的 转化子为含有vioB基因、ADHl终止子、TEF2启动子、VioC基因的转化子；以Primeri和 Primerj为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为1158bp的目的片段的转化子为含有VioC 基因、ADHl终止子、TEF2启动子、vioD基因的转化子；以Primerk和Primer1为引物进 行PCR扩增，PCR扩增产物为1256bp的目的片段的转化子为含有VioD基因、ADHl终止子、 TEF2启动子、vioE基因的转化子；以Primerm和Primern为引物进行PCR扩增，PCR扩 增产物为1134bp的目的片段的转化子为含有VioE基因、ADHl终止子、LEU2的转化子；以 Primer〇和Primerp为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为977bp的目的片段的转化子为 含有LEU2、URR2的转化子；以Primerq和Primerr为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为 555bp的目的片段的转化子为含有URR2的转化子，含有所有目的片段的转化子为最终得到 的目的转化子。
[0179] 3、紫色杆菌素的生产和鉴定
[0180] 将步骤2中验证正确整合的酵母菌株，接种于YH)培养基中，培养2-3天后收集， 冻干，破壁后用甲醇对酵母细胞内的紫色杆菌素进行提取，并通过HPLC进行检测。以即实 施例1获得的含有一个重复重组盒的酵母菌株为对照。
[0181] 检测结果如图2所示：同对照菌株相比，从正确整合的酵母菌株提取的样品有单 一的峰，即为紫色杆菌素。说明本发明成功生产得到紫色杆菌素。
【主权项】
1. 一种酿酒酵母人工染色体，其包括n个重复重组盒、2个端粒重复序列、2个隔离子序 列、着丝粒-自主复制序列和po 130基因； 每个所述重复重组盒由上游重组目标序列、报告基因、筛选标记基因和下游重组目标 序列组成；所述报告基因和所述筛选标记基因均位于所述上游重组目标序列和所述下游重 组目标序列之间；所述n为大于等于1的自然数。2. 根据权利要求1所述的酿酒酵母人工染色体，其特征在于： 所述n为1或2 ; 所述酿酒酵母人工染色体从上游至下游依次包括一个端粒重复序列、一个隔离子序 列、第一个重复重组盒、着丝粒-自主复制序列、P〇130基因、第二个重复重组盒、另一个隔 离子序列和另一个端粒重复序列； 或所述酿酒酵母人工染色体从上游至下游依次包括一个端粒重复序列、一个隔离子序 列、第一个重复重组盒、着丝粒-自主复制序列、P〇130基因、另一个隔离子序列和另一个端 粒重复序列。3. 根据权利要求1或2所述的酿酒酵母人工染色体，其特征在于： 所述端粒重复序列均为序列表中序列1 ; 所述隔离子序列均为序列表中序列2 ; 所述着丝粒-自主复制序列为序列表中序列4 ; 所述p〇130基因序列为序列表中序列6 ; 所述报告基因为RFP基因； 所述筛选标记基因为TRPl基因； 所述第一个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列9 ; 所述第一个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列10 ; 所述第二个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列11 ; 所述第二个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列12 ; 所述第一个重复重组盒的序列为序列表中序列15 ; 所述第二个重复重组盒的序列为序列表中序列16。4. 一种酿酒酵母人工染色体的制备方法，为将n个重复重组盒整合到pNE0C14载体中， 得到酿酒酵母人工染色体。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于： 每个所述重复重组盒由上游重组目标序列、报告基因、筛选标记基因和下游重组目标 序列组成；所述报告基因和所述筛选标记基因均位于所述上游重组目标序列和所述下游重 组目标序列之间；所述n为大于等于1的自然数。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将n个重复 重组盒转入含有线性化的PNE0C14载体的酿酒酵母中，得到重组菌，提取所述重组菌的质 粒，即得到酿酒酵母人工染色体； 所述含有线性化的PNE0C14载体的酿酒酵母为将线性化的pNE0C14载体转入宿主酿酒 酵母得到的中间菌； 所述线性化的PNE0C14载体为用限制性内切酶PmeI酶切pNE0C14载体后得到的线性 DNA分子； 所述PNE0C14载体的核苷酸序列为序列表中序列7所示的环状DNA分子。7. 根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述n为1或2 ; 所述端粒重复序列均为序列表中序列1 ; 所述隔离子序列均为序列表中序列2 ; 所述着丝粒-自主复制序列为序列表中序列4 ; 所述p〇130基因序列为序列表中序列6 ; 所述报告基因为RFP基因； 所述筛选标记基因为TRPl基因； 所述第一个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列9 ; 所述第一个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列10 ; 所述第二个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列11 ; 所述第二个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列12 ; 所述第一个重复重组盒的序列为序列表中序列15所示； 所述第二个重复重组盒的序列为序列表中序列16所示。8. -种DNA片段，为权利要求1中所述的重复重组盒。9. 含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌，为将权利要求1-3中任一所述的酿酒酵母人工 染色体导入酿酒酵母中得到的酵母菌。10. 权利要求1-3中任一所述的酿酒酵母人工染色体或权利要求8所述的DNA片段或 权利要求9所述的含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌在表达外源基因中的应用； 或权利要求1-3中任一所述的酿酒酵母人工染色体或权利要求8所述的DNA片段或权 利要求9所述的含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌在制备表达外源基因的产品中的应用。11. 一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：将含有外源基因的DNA片段导入权利要 求9所述的含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌中，得到重组菌A，培养所述重组菌A，实现外 源基因的表达； 所述外源基因的DNA片段包括上游同源臂、外源基因表达盒、筛选标记基因和下游同 源臂； 所述上游同源臂为所述酿酒酵母人工染色体的重复重组盒的上游重组目标序列； 所述下游同源臂为所述酿酒酵母人工染色体的重复重组盒的下游重组目标序列。12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于： 所述外源基因为合成beta胡萝卜素的基因或合成紫色杆菌素的基因； 所述含有合成beta胡萝卜素基因的DNA片段的核苷酸序列为序列17 ; 所述含有合成紫色杆菌素基因的DNA片段的核苷酸序列为序列18。
【专利摘要】本发明公开一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用。本发明的酿酒酵母染色体包括2个端粒重复序列、2个隔离子序列、着丝粒-自主复制序列、pol30基因和n个重复重组盒。通过试验证明：本发明的酿酒酵母染色体的营养缺陷型的标记基因少，可以在不进行筛选的情况下进行正常和稳定的生长，不仅提高了外源基因在酵母中的表达量、稳定性和拷贝数，并且可以对整合进入基因组的基因进行增加、筛减乃至扩展新的多基因簇，在酵母内成功实现了beta胡萝卜素和紫色杆菌素的快速外源表达，为多种外源途径的酵母异源生产提供了快速可行的方法，可以满足基因工程、代谢工程及合成生物学领域的应用需求。
【IPC分类】C12N1/19, C12N15/11, C12N15/81, C12R1/865
【公开号】CN105087632
【申请号】CN201510564754
【发明人】戴俊彪, 林继伟, 吴庆余, 董俊凯
【申请人】清华大学, 无锡青兰生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月7日