一种提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素资源种类繁多、年产量巨大，其综合利用既可带来经济效益，又能 够减少因焚烧等不当处理引起的环境污染。木糖组分在木质纤维素原料中含量高达 30%左右，仅次于葡萄糖组分，对其进行综合利用可以显著提高原料利用率。酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)是广泛用于食品和工业生产的微生物，其具有鲁棒性强、代 谢旺盛以及食品级安全等特性。通过基因工程手段，将合适的代谢途径关键酶引入酿酒酵 母，可以获得能够将木糖转化为各种目标产品的细胞工厂。目前，主要直接的目标产品包 括燃料乙醇、木糖醇、木糖酸等（以酿酒酵母为细胞工厂的木质纤维素原料对木糖组分利 用的研究进展。沈煜，侯进，肖林，夏蕊蕊，鲍晓明。生物产业技术，2014,05,76-81)。木糖 的吸收是酿酒酵母利用木糖的第一步。酿酒酵母没有专门的木糖运输蛋白，其对木糖的吸 收依赖于己糖运输蛋白。这些己糖运输蛋白的表达受细胞内外葡萄糖信号的调控，并且它 们对木糖的运输受到葡萄糖的竞争性抑制。其中，当周围环境没有葡萄糖和蔗糖时，转录 因子Rgtl直接结合在转运蛋白基因HXT1，HXT2,HXT3,以及HXT4的启动子区域，阻遏它们 的表达。当周围环境中存在葡萄糖或蔗糖时，酿酒酵母细胞膜上蛋白Rgt2和Snf3将信号 传递到细胞内，促使原本和Rgtl结合的Mthl和Stdl降解。脱离了Mthl和Stdl的Rgtl 进而被磷酸化，脱离运输蛋白基因的启动子区域，这些基因才得以表达。而另一方面，当 周围环境中葡萄糖浓度很高时，另一个转录因子Migl结合在HXT2,HXT3,和HXT4启动子 区域，阻遏它们的表达（Busti,S.，Coccetti,P.，Alberghina,L.，andVanoni,M.Glucose signaling-mediatedcoordinationofcellgrowthandcellcycleinSaccharomyces cerevisiae.Sensors, 2010, 10, 6195-6240.)。此外，另有研究表明，敲除RGTl基因还能够 促进另一个转运蛋白HXT7基因的表达，其具体机制尚不明确（Dlugai，S.，Hippier，S.，Wi eczorke,R. ,andBoles,E.Glucose-dependentand-independentsignallingfunctions oftheyeastglucosesensorSnf3.FebsLett, 2001，505, 389-392.)。但检索发现，利用 缺失RGTl基因的方法提高带有木糖利用途径的重组酿酒酵母的木糖利用能力的文献或专 利还未见报道。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用缺失RGTl基因提高 酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法。
[0004] 本发明所述提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法，其特征是：通过DNA同源 重组，将含有筛选标记基因表达框DNA序列Deletioncassette插入到含有木糖转化途径 的酿酒酵母染色体上RGTl基因表达编码框区域，破坏RGTl基因的表达，获得敲除转录因子 基因RGTl(系统名：YKL038W)的含有木糖转化途径的酿酒酵母菌株，以实现该酿酒酵母木 糖吸收和利用能力的提尚。
[0005] 上述的提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法中：所述DNA序列Deletion cassette是2139bp的核苷酸序列，其序列如SEQIDNo.1所示。
[0006] 上述的提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法中：所述木糖转化途径是指将木 糖转化为木糖醇、木糖酸或者乙醇的代谢途径。
[0007] 上述的提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法中：所述含有木糖转化途径的酿 酒酵母优选是含有木糖利用途径的菌株酿酒酵母BSPC085,所述敲除RGTl基因的菌株优选 为酿酒酵母BSPC085-RT。
[0008] 上述的提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法中：所述酿酒酵母菌株 BSPC085-RT验证其RGTl确已敲除的方法是用转化子的染色体DNA为模板，用引物rgtl-1 和引物rgtl-6进行PCR扩增，获得的条带为2139bp;其中，
[0009]引物rgtl-1 的核苷酸序列是：TGTGACGTGGCTTATGAGCACCAG，
[0010]引物rgtl-6的核苷酸序列是：TGGCAATGGCAATAGTGATGGCACC。
[0011] 针对现有技术中酿酒酵母利用木糖时在转运环节的限制，本发明基于以上调控机 制，提供了一种提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法，通过该方法提高以木糖为原料 生产乙醇、木糖醇、木糖酸等化合物的基因工程菌株的木糖吸收和利用能力，并实现了将获 得的基因工程菌株在生产中的应用。
[0012] 本发明是通过敲除酿酒酵母菌株中的转录因子基因RGTl实现的。通过敲除RGTl 基因可以显著提高木糖条件下酿酒酵母己糖转运蛋白的表达水平，从而提高菌株吸收和利 用木糖的能力。实验证实通过缺失RGTl的方法，酿酒酵母中己糖转运蛋白HXT1、HXT2的 在木糖条件下的表达水平分别提高到原来的17. 32和3. 75倍。相应的，利用缺失RGTl的 方法，提高了带有木糖利用途径的重组酿酒酵母的木糖利用能力，木糖利用速率从原来的 0? 23g/L/h，提尚到 0? 34g/L/h，提尚了 47. 8%。
【附图说明】
[0013] 图1:用于RGTl敲除的DNA片段的获得流程图。
[0014] 图2 :RGT1敲除对菌株木糖发酵的影响。
[0015] 发酵培养基以20g/L木糖为唯一碳源，方块代表酿酒酵母菌体干重，上三角代表 木糖，下三角代表乙醇。用空心符号表示的是RGTl敲除菌株BSPC085-RT，实心符号代表未 敲除RGTl的对照菌株BSPC085。
[0016]图3 :RGT1敲除对菌株葡萄糖-木糖共发酵的影响。
[0017] 发酵培养基以20g/L木糖和20g/L葡萄糖为碳源，方块代表酿酒酵母菌体干重， 圆形代表葡萄糖，上三角代表木糖，下三角代表乙醇。用空心符号表示的是RGTl敲除菌株BSPC085-RT，实心符号代表未敲除RGTl的对照菌株BSPC085。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1:用于RGTl敲除的DNA片段的获得
[0019] 用于RGTl敲除的DNA片段通过融合PCR技术获得，扩增条件中退火温度均为 60 °C，流程如图1所示，具体步骤如下：
[0020] 1)以酿酒酵母BSPC085 (山东大学，彭炳银硕士学位论文，2011)的染色体DNA为 模板，用引物rgtl-1和引物rgtl-2扩增获得DNA片段FragmentI(384bp)，该片段和RGTl 基因上游序列同源；用引物rgtl-5和引物rgtl-6扩增获得DNA片段Fragment3 (398bp)， 该片段和RGTl基因下游序列同源。
[0021]2)以质粒pUG6 (Gilldener，U.，Heck,S.，Fielder,T.，Beinhauer，J.，and Hegemann,J.H.Anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeatedusein buddingyeast.Nucleicacidsresearch, 1996, 24, 2519-2524.)为模板，用引物rgtl-3 和引物rgtl-4扩增获得DNA片段Fragment2 (1404bp)，该片段有G418抗性基因表达框 TEFp-KanR-TEF