063] 上述方法中，
[0064] 所述外源基因可以是多个；
[0065] 所述外源基因为合成beta胡萝卜素的基因或合成紫色杆菌素的基因；
[0066] 所述含有合成beta胡萝卜素基因的DNA片段的核苷酸序列为序列17 ;
[0067] 所述含有合成紫色杆菌素基因的DNA片段的核苷酸序列为序列18。
[0068] 本发明公开一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用。通过试验证明：本发明的 酿酒酵母染色体的营养缺陷型的标记基因少，可以在不进行筛选的情况下进行正常和稳定 的生长，不仅提高了外源基因在酵母中的表达量、稳定性和拷贝数，并且可以对整合进入基 因组的基因进行增加、筛减乃至扩展新的多基因簇，在酵母内成功实现了beta胡萝卜素和 紫色杆菌素的快速外源表达，为多种外源途径的酵母异源生产提供了快速可行的方法，可 以满足基因工程、代谢工程及合成生物学领域的应用需求。
【附图说明】
[0069] 图1为样品与beta胡萝卜素标准品HPLC峰图。
[0070] 图2为紫色杆菌素样品HPLC峰图。
【具体实施方式】
[0071] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0072] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0073] 下述实施例中的pRS403载体、pRS404载体和pRS414载体均在文献"Robert S.Sikorski,PhilipHieter,ASystemofShuttleVectorsandYeastHostStrains DesignedforEfficientManipulationofDNAinSaccharomycescerevisiae. Genetics，1989, 122:19-27. "中公开过，公众可从清华大学获得D
[0074] 下述实施例中的酿酒酵母JDY52,其为酿酒酵母BY4727和酿酒酵母BY4733交 配后形成的二倍体菌株产孢得到的单倍体菌株，其基因型为MATa，his3A200leu2A〇 lys2A〇trplA63ura3A〇metl5A〇,公众可从清华大学获得D
[0075]下述实施例中的酿酒酵母BY4727(SaccharomycescerevisiaeBY4727)和酿 酒酵母BY4733(SaccharomycescerevisiaeBY4733)均在文献"BrachmannCB，Davies A，CostGJ，CaputoE，LiJ，HieterP，BoekeJD.Designerdeletionstrainsderived fromSaccharomycescerevisiaeS288C:ausefulsetofstrainsandplasmidsfor PCR-mediatedgenedisruptionandotherapplications.Yeast，1998, 14(2):115-32. " 中公开过，公众可从清华大学获得。
[0076]实施例1、酵母染色体的制备方法
[0077] -、含有pNE0C14载体的酵母菌株的获得
[0078] I、pNEOC 1载体的获得
[0079] (1)根据酿酒酵母天然端粒的结构，设计了带有端粒重复序列以及Xcore的DNA片 段，并通过商业基因合成的办法合成获得PUC19-F126载体。用限制性内切酶BsaI和AgeI 对PUC19-F126载体进行双酶切，回收得到大小为770bp的片段，即为端粒重复序列和Xcore 的DNA片段，该片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0080] (2)以去掉BsaI和BsmBI酶切位点的pRS414为模板，采用引物 I(GCACCGGITTCCCCGAAAAGTGCCACCT)和引物 2(TAGGTCTCTTGTGTTTAAACATGTGCGCGGAACCCCT ATTT)，使用pfu酶进行PCR扩增，得到大小为4816bp的PCR扩增产物，即带有通过引物引 入的BsaI和AgeI酶切位点的pRS414载体，用限制性内切酶BsaI和AgeI对带有通过引物 引入的BsaI和AgeI酶切位点的pRS414载体进行双酶切，回收载体片段。
[0081] (3)将步骤⑴获得的端粒重复序列和Xcore的DNA片段和步骤⑵获得的载体 片段连接，得到PNEOCl载体。
[0082] 2、pNEOC10载体的获得
[0083] (1)隔离子的合成
[0084]人工合成引物 3(catgTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTAGGGcctgcagggcatgc)和引物 4(ccgggcatgccctgcaggCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACC CTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA)，并将等摩尔量的引物3和引物4混合，加热变性 后室温冷却，得到大小为82bp的DNA片段，即为隔离子，隔离子是10个重复的TTAGGG单元， 其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0085] (2)用限制性内切酶AgeI和NcoI对步骤1获得的pNEOCl载体进行双酶切，回收 得到大小为5561bp的载体大片段。
[0086] (3)将步骤（1)获得的大小为82bp的DNA片段和步骤（2)获得的大小为5561bp 的载体大片段进行连接，得到pNEOCIO载体。连接之后，在重组载体pNEOCIO上，AgeI和 NcoI识别酶切位点消失，同时引入SbfI和SphI酶切位点。
[0087] 3、pNEOC 11载体的获得
[0088] (1)HIS3基因片段的获得
[0089] 以pRS403 载体为模板，采用引物 5 (TTACgagctcAGTCAGGGAAGTCATAACACAGTCC)和 引物 6 (TAggtctcITGTGTTTAAACCTGTGCGGTAITTCACACCGC)，使用pfu酶进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物，即为HIS3基因片段，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0090] 用限制性内切酶SacI和BsaI对上述PCR扩增产物进行双酶切，得到大小为 1168bp的DNA片段。
[0091]PCR扩增反应条件：94°C，3min;94。(：，30s，55。(：，30s，68。(：，45s，30cycles;68。(：， 3min;4°C，+ 00 〇
[0092] (2)用限制性内切酶AgeI和BsaI对pUC19-F126载体进行双酶切，回收大小为 770bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0093] (3)用限制性内切酶SacI和XmaI对步骤2获得的pNEOCIO载体进行双酶切，回收 得到大小为5593bp的载体大片段。
[0094](4)将步骤⑴获得的大小为1160bp的HIS3基因片段、步骤⑵获得的大小为 770bp的DNA片段和步骤（3)获得的大小为5593bp的载体大片段连接，利用AgeI和XmaI是同尾酶，得到PNE0C11载体。
[0095]4、pNEOC12载体的获得
[0096] 以去掉BsaI和BsmBI酶切位点的pRS414为模板，采用引物 7 (TTAgcatgcCACCGCATAGGCAAGTGCAC)和引物 8(TTActcgagCCGAAgagacgCGATcgtctcATGAC accggtactagtGAAAAGTGCCACCTGGGTCC)，使用pfu酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即 TRPl基因和CEN/ARS，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。
[0097] 用限制性内切酶XhoI和SphI对上述PCR扩增产物和步骤3获得的pNEOCll载体 进行双酶切，连接，得到PNE0C12载体。
[0098]5、pNEOC13载体的获得
[0099] (1)隔离子的合成
[0100]人工合成引物9 (catgggcgccTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTAGGGTTAGGGggatcc)和引物10 (AATTggatccCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTA ACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAggcgcc)，并将等摩尔量的引物9和引物10混合，加热变性后 室温冷却，得到大小为SObp的DNA片段，即为隔离子，其核苷酸序列如序列表中序列5所 不。
[0101] (2)用限制性内切酶AgeI和NcoI对步骤4获得的PNE0C12载体进行双酶切，回收 得到大小为6751bp的载体大片段。
[0102] (3)将步骤⑴获得的大小为80bp的DNA片段和步骤⑵获得的大小为6751bp 的载体大片段连接，得到PNE0C13载体。连接之后，在重组载体pNE0C13上，EcoRI识别酶 切位点消失，同时引入BamHI和KasI酶切位点。
[0103] 6、pNE0C14载体的获得
[0104]以pJD280载体为模板，采用引物11 (GCGTAATACGACTCACTATAGGGC)和引物12 (GG actagtGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACC)，使用KOD酶进行PCR进行PCR扩增，得到大小为 1896bp的PCR扩增产物，即p〇130基因，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。
[0105]PCR扩增反应：94 °C，3min;94 °C，30s，55 °C，30s，68 °C，75s，30cycles;68。(：， 3min;4