°C，+ 00 〇
[0106] 用限制性内切酶SpeI和XhoI对大小为1896bp的PCR扩增产物和pNE0C13载体 进行双酶切，连接，得到PNE0C14载体。
[0107] 对PNE0C14载体进行测序，测序结果表明：pNE0C14载体为序列表中序列7所示的 环状DNA分子。
[0108] 7、pNE0C14载体线性化
[0109] 利用限制性内切酶PmeI对上述步骤6获得的pNE0C14载体进行酶切，37°C酶切3 小时，得到酶切混合物。
[0110] 将酶切混合物利用酵母常规转化方法转化基因组上敲除p〇130基因，且含有 URA-p〇130质粒的酿酒酵母菌株（该酿酒酵母菌株为基因组上敲除p〇130基因，且含有 URA-p〇130质粒的酿酒酵母JDY52，URA-p〇130质粒的核苷酸序列如序列表中序列8所示）， 得到转化后的酵母菌株。
[0111]将转化后的酵母菌株在缺乏色氨酸的培养基上进行筛选，获得转化子。待单克隆 长出后，从每个平板上随机挑选4个单克隆在新的SC-TRP平板上划线。30°C培养约48小 时后，按顺序影印至SC-URA，SC-HIS，SC-TRP的平板上。30°C培养约24小时后，从含有酶切 混合物的平板上，挑选两个TRP+，HIS-，URA-的单克隆，并在SC-TRP平板上划线保存菌株， 得到含有PNE0C14载体的酵母菌株。
[0112] 二、含有新染色体的酵母菌株的获得
[0113] 1、重复重组盒的设计与合成
[0114]重复重组盒中的重组目标序列的长度为500bp，随机生成。设定的GC含量为50%， 并经过NCBI blast检测，在已测序数据库中没有任何同源。本发明的重复重组盒1的重组 目标序列为URRl和URR2,其中，URRl序列如序列表中序列9所示，URR2序列如序列表中序 列10所示；本发明的重复重组盒2的重组目标序列为URR3和URR4,其中，URR3序列如序列 表中序列11所示，URR4序列如序列表中序列12所示。URR1、URR2、URR3、URR4都是由无锡 青兰生物科技有限公司合成，克隆在PMV载体中，测序证实和设计的序列完全一致。
[0115] 2、RFP基因的获得
[0116] 根据GeneBank中RFP的序列，设计的RFP基因的序列如序列表中序列13所示。由 无锡青兰生物科技有限公司合成，克隆在PMV载体中，测序证实和设计的序列完全一致。
[0117]3、酵母选择性标记的获得
[0118]以pRS404载体为模板，采用引物13 (TGATGTggtctcGTGAGCTGTGCGGTAITTCACACCG) 和引物14(AGCGTGggtctcTAGCGAGATTGTACTGAGAGTGCAC)，使用KOD酶进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物，即为TRPl基因，其核苷酸序列如序列表中序列14所示，将其克隆至pSMART HCKan载体，进行测序，证实未发生突变。
[0119] 4、带有重复重组盒的酵母菌株的获得
[0120] (1)含有一个重复重组盒的酵母菌株的获得
[0121] 以序列表中序列15所示的DNA分子为模板，采用引物15(ATGTCTGTTATTAATTTCACA GGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGGTCATCTAAGCACAGTCGCG)和引物16 (CTATTTCTTAGCATTTT TGACGAAATITGCTAITITGTTAGAGTCTITTATTAGCGTGGCGAGCCCGCCT)，使用KOD酶进行PCR扩增， 得到大小为3475bp的PCR扩增产物。
[0122] PCR扩增反应条件：94 °C，3min;94 °C，30s，55 °C，30s，68 °C，3min，30cycles ; 68°C，5min;4°C，+ ⑴。
[0123] 将上述PCR扩增产物（序列15)转化上述步骤一获得的含有pNE0C14载体的酵母 菌，筛选得到在SC-HIS上能够生长、在SC-TRP上不能生长的克隆，提取该克隆的基因 组，设计引物，对插入的片段所在的整合位点左臂，右臂和全长，进行PCR验证，得到含有一 个重复重组盒的酵母菌株。验证的具体步骤如下：
[0124] 含有一个重复重组盒的酵母菌株的左臂采用Fl引物（CGCATAGGCAAGTGCACAAAC) 和Rl引物（GCGTCAGGACGACTAGCATG)，使用KOD酶进行PCR扩增，得到大小为520bp的PCR扩 增产物；而采用F2 引物（CGCATAGGCAAGTGCACAAAC)和R2 引物（ATGGAGATGAGTCGTGGCAAG)， 使用KOD酶进行PCR扩增，无任何条带。
[0125]含有一个重复重组盒的酵母菌株的右臂采用F3引物（ACGGTCACAGCTTGTCTGTAAG) 和R3引物（AACGCCGGAGTATGGGAATG)，使用KOD酶进行PCR扩增，得到大小为717bp的PCR扩 增产物；而采用F4 引物（ACGGTCACAGCTTGTCTGTAAG)和R4 引物（CAGCAAGTCAGCATCGGAATC)， 使用KOD酶进行PCR扩增，无任何条带。
[0126] 含有一个重复重组盒的酵母菌株的全长采用F5引物（CGCATAGGCAAGTGCACAAAC) 和R5引物（ACGGTCACAGCTTGTCTGTAAG)，使用KOD酶进行PCR扩增，得到大小为3941bp的 PCR扩增产物。
[0127] (2)含有二个重复重组盒的酵母菌株
[0128] 以序列表中序列16所示的DNA分子为模板，采用引物17(CAGCAGTTAAGGCCTTCCACC TCTCACCCAATATTCTGCCTACTTGGCCAGTCAGTCTCGTATTTCTCTTGGAGA)和引物 18(ATAAGCTTGATA TCGAAITCCTGCAGCCCGGGGGATCCTAACGCCCCTAACCGAAGGAACTAGAGGTCTTCTTTA)，使用KOD酶进 行PCR扩增，得到大小为3387bp的PCR扩增产物。
[0129]PCR扩增反应条件：94 °C，3min;94 °C，30s，55 °C，30s，68 °C，3min，30cycles; 68°C，5min;4°C，+ ⑴。
[0130] 将上述PCR扩增产物转化上述步骤（I)获得的含有一个重复重组盒的酵母菌 株，筛选得到在SC-HIS和SC-LEU上能够生长的克隆，提取该克隆的基因组，设计引物 19 (CGTCGGATGGAGAAGAAAAA)和引物 20 (CGGCCAAACAACCAAITACT)，对插入的片段所在的整 合位点进行PCR验证，扩增得到大小为1088bp的PCR扩增产物，即为含有两个重复重组盒 的酵母菌株，提取质粒，即为酵母人工染色体。第一个重复重组盒整合位点位于TRPl基因 内，同源臂分别为CTAITTCTTAGCAITITTGACGAAATITGCTAITITGTTAGAGTCTITTA和CAAACTIT CACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACAT;第二个重复重组盒整合位点位于pol30 基因与隔离子之间，同源臂分别为CAGCAGTTAAGGCCTTCCACCTCTCACCCAATAITCTGCCTACTTGGC CA和TTAGGGGCGTTAGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTAT。
[0131] 按照上述方法，本发明可引入多个重复重组盒，得到含有多个重复重组盒的酵母 菌株。
[0132] 实施例2、酵母染色体在生产beta胡萝卜素中的应用
[0133] 1、目的片段的合成
[0134] 人工合成序列表中序列17所示的DNA片段，该片段依次由URR1、TDH3启动子、 crtE基因、TEFl终止子、ADHl启动子、crtl基因、ADHl终止子、TEF2启动子、crtYB基因、 TEF2终止子、LEU2(筛选标记基因）和URR2组成。所有的启动子、基因、终止子均为无缝连 接。
[0135] 2、转化
[0136] 将步骤1合成的序列表中序列17所示的DNA片段转化到实施例1制备的含有一个 重复重组盒的酵母菌株中，利用酵母同源重组，得到正确整合的酵母菌株。并对其进行PCR 鉴定。其中PCR鉴定的步骤如下：
[0137] 以转化子的基因组DNA为模板，以PrimerA和PrimerB为引物进行PCR扩增， PCR扩增产物为568bp的目的片段的转化子为含有URRl的转化子；以PrimerC和Primer D为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为752bp的目的片段的转化子为含有URR1、TDH3启 动子、crtE基因的转化子；以PrimerE和PrimerF为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为 735bp的目的片段的转化子为含有crtE基因、TEFl终止子、ADHl启动子、crtl的转化子； 以PrimerG和PrimerH为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为880bp的目的片段的转化子 为含有crtl基因、ADHl终止子、TEF2启动子、crtYB的转化子；以PrimerI和PrimerJ为 引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为1335bp的目的片段的转化子为含有crtYB基因、TEF2 终止子和LEU2的转化子；以PrimerK和PrimerL为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物为 977bp的目的片段的转化子为含有LEU2和URR2的转化子；以PrimerM和PrimerN为引 物进行PCR扩增，PCR扩增产物为555bp的目的片段的转化子为含有URR2的转化子，含有 所有目的片段的转化子为最终得到的目的转化