适合火焰南天竹转基因 使用，该菌株侵染能力较强。该菌株购买于宝生物工程大连有限公司。
[0039] 植物表达载体选用PCAMBIA2301植物表达载体，该植物表达载体携带报告基因 gus(|3-葡萄糖苷酸酶基因），便于转基因植物的检测，缩短检测时间。该植物表达载体购 买于英俊（Invitrogen)生物技术公司。
[0040] 实施例1
[0041] 火焰南天竹的转基因方法包括如下步骤：
[0042] 1、菌种活化
[0043] ①将质粒pCAMBIA2301转化到农杆菌LBA4404中，获得含质粒pCAMBIA2301的重 组农杆菌LBA4404。
[0044] ②将含质粒pCAMBIA2301的重组农杆菌LBA4404在添加Km50mg/L(卡那霉素） 和Rif50mg/L(利福平）的YEB固体培养基上划线，28°C培养2天。
[0045] ②挑取YEB固体培养基上生长的单菌落2~3个，接种到50mL添加Km50mg/L 和Rif50mg/L的YEB液体培养基中，28°C，220rpm在摇床中振荡培养约12-16h至菌液的 0D600 值为 0. 8。
[0046] ③常温下，菌液于5000rpm离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽 量将上清液去除，用IOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养（转速为8000转/min，温度 为15°C)大约1小时测定0D600值为0. 4为，最佳（0D600值值很重要，不能低于0. 4,不能 高于0. 6,控制在0. 4~0. 6之间，0. 4最佳，应尽量接近0. 4)。活化好的菌液可以用来做下 一步植物材料侵染。
[0047] 2、火焰南天竹转基因
[0048] ①植物材料准备
[0049] 将火焰南天竹组培苗的叶片剪成0. 4cm2的小块，把它们放在100mLMS液体培养基 中进行预培养，预培养的温度为25°C，时间为8小时，光照为2000-3000LX。
[0050] ②火焰南天竹的转基因操作方法
[0051] 侵染：预培养完成后，将预培养的MS液体倒出后，将100mL悬浮菌液倒入剪好的叶 片中，轻微摇匀，浸染60分钟，侵染过程中每隔5分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面 积。侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液。
[0052] 筛选诱导芽培养：侵染后的叶片接种在火焰南天竹转基因苗培养基S2上，使叶片 的伤口与培养基充分接触，在培养室中25 ± 2°C，光照培养（光照强度2000-3000LX，光周期 8小时暗培养，16小时光照）。培养40天左右，火焰南天竹叶片边缘会有白色愈伤组织长 出，抗性愈伤经过约40d左右的培养以后，可分化出抗性植株。此时再进行一次⑶S组织染 色检测，染色方法为：将抗性植株从组培瓶中取出，任剪一块植物叶片，要保证叶片四周都 有伤口，放置到⑶S染色液中，37°C，过夜染色。染色后用70 %的酒精脱去叶片中的叶绿素， 脱色以后呈蓝色的为转基因植株，没有颜色的为非转基因植株，将非转基因植株去除。
[0053] 火焰南天竹的愈伤的继代采用继代培养基Sl。
[0054] 筛选诱导根培养：取上一步选出的转基因植株放入火焰南天竹转基因苗生根培养 基S3上，在培养室中25±2°C，光照培养（光照强度2000-3000LX，光周期8小时暗培养，16 小时光照），培养40d以后生根。此时再进行一次⑶S组织染色检测，染色方法为：将抗性植 株从组培瓶中取出，任剪一块植物叶片和一段根系，要保证叶片四周都有伤口，将他们都放 置到⑶S染色液中，37°C，过夜染色。染色后用70%的酒精脱去叶片中的叶绿素，根系和脱 色以后叶片均呈蓝色的为转基因植株，叶片、根系中任一有没有呈蓝色的为非转基因植株， 将非转基因植株去除。
[0055] 统计火焰南天竹转基因的转化率，转化率=(转基因植株总数/接种的外植体总 数）X100%。本实施例火焰南天竹的转化率为15%。筛选诱导芽培养过程中，污染率极低， 仅为1.2%。
[0056] 实施例2
[0057] 改变侵染时间，侵染时间分别设置为10分钟，20分钟，30分钟，40分钟，50分钟， 70分钟，80分钟，其余步骤同实施例1，考察侵染时间对火焰南天竹转化率的影响。
[0058] 结果如表1所示。
[0059] 表1侵染时间对火焰南天竹转化率的影响
[0060]
[0061] 如表1所示，时间较短时，火焰南天竹的转化率较低，随着侵染时间的增长，转化 率有所升高。当侵染时间达到80分钟时，转化率反而下降，并且农杆菌和其他杂菌的污染 也较严重，污染率达7. 8%。
【主权项】
1. 一种火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，包括： (1) 将外源质粒载体转入农杆菌LBA4404中，获得重组农杆菌； (2) 活化培养所述的重组农杆菌至0D600为0. 4~0. 6,然后侵染火焰南天竹的叶片外 植体50~70min ; (3) 侵染后的叶片外植体依次经诱芽培养、生根培养获得火焰南天竹植株，从火焰南天 竹植株中筛选得到转基因火焰南天竹。2. 如权利要求1所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，所述的外源质粒载体 为PCAMBIA2301或携带外源基因的pCAMBIA2301。3. 如权利要求1所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，侵染前，对所述的叶片 外植体进行预培养。4. 如权利要求1所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，所述的叶片外植体为 0. 2~0. 6cm2的叶块。5. 如权利要求1所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，所述侵染的方法为：使 所述的叶片外植体浸没在重组农杆菌菌液中，每隔3~7min摇动菌液。6. 如权利要求5所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，侵染后，吸干所述的叶 片外植体表面的菌液后进行诱芽培养。7. 如权利要求1所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，所述诱芽培养的培养 基为添加抗生素、蔗糖、琼脂、TDZ 2~3mg/L和2, 4-D 0. 1~0. 3mg/L的MS培养基。8. 如权利要求1所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，所述生根培养的培养 基为添加抗生素、蔗糖、琼脂和NAA 0. 3~0. 5mg/L的1/2MS培养基。9. 如权利要求1所述的火焰南天竹的转基因方法，其特征在于，步骤（3)中，叶片外植 体经诱芽培养后获得无根植株，对所述的无根植株进行鉴定，将筛选出的转基因无根植株 进行生根培养。
【专利摘要】本发明公开一种火焰南天竹的转基因方法，包括：将外源质粒载体转入农杆菌LBA4404中，获得重组农杆菌；活化培养所述的重组农杆菌至OD600为0.4～0.6，然后侵染火焰南天竹的叶片外植体50～70min；侵染后的叶片外植体依次经诱芽培养、生根培养获得火焰南天竹植株，从火焰南天竹植株中筛选得到转基因火焰南天竹。本发明建立了一个高效、快速、稳定的火焰南天竹遗传转化体系，转化率可达到10％以上，为进一步应用遗传转化方法改良火焰南天竹品种提供实践基础，有利于今后火焰南天竹分子育种工作的发展。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN105087642
【申请号】CN201510629324
【发明人】贾思振, 张立伟, 王媛花, 颜志明
【申请人】江苏农林职业技术学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月28日