一种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和转基因研究领域，可用于转基因的定向插入和多基因的 定向叠加。更具体地讲，本发明涉及一种含有35bpfrt特异性重组位点的表达载体，同时 涉及到含有frt特异性重组位点表达载体的构建方法，以及该发明在植物转基因和基因工 程中的应用。
【背景技术】
[0002] 酵母FLP/Frt位点特异性重组系统为双组份系统，FLP重组酶是酵母2ym质粒编 码的特异性蛋白，可特异识别Frt位点DNA序列，Frt位点DNA序列包含长度为13bp的三个 重复单元，其中一个重复单元是其它两个重复单元的反向重复，两个反向重复单元间有8bp 的间隔序列，间隔序列的方向决定了Frt位点的方向（FutcherAB1988The2microncircle plasmidofSaccharomycescerevisiae.YeastAdT-A(X)c3FLP重组酶可与Frt位点三个重 复序列结合，并在间隔序列的边界切割DNA，引起同一DNA分子上两个Frt位点间的DNA片 段发生倒位或剔除（SenecoffJF，BrucknerRC，CoxMM1985TheFLPrecombinaseofthe yeast2-micronplasmidcharacterizationofitsrecombinationsite.Proc.Natl. Acad.Sci. 82 :7270-7274.;AndrewsBJ，ProteauGA，BeattyLG，SadowskiPD1985The FLPrecombinaseofthe2microncircleDNAofyeast:interactionwithitstarget sequences.Cell40 :795-803.)，或者引起不同DNA分子上的DNA片段在Frt位点发生整合 (HuangLC，WoodEA，CoxMM1991Abacterialmodelsystemforchromosomaltargeting. NucleicAcidsResl9 :443-448.)D
[0003]在植物基因组中，引入的FLP/Frt位点特异性重组系统已被证实同样能发 挥其功能，这些功能已在水稻和玉米（LyznikLA，MitchellJC，HiyaramaL，Hodges TK1993ActivityofyeastFLPrecombinaseinmaizeandriceprotoplasts.Nucleic AcidsRes21 :969-975.)、烟草（LloydAM，DavisRW1994Functionalexpressionofthe yeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.MolGen Genet242 :653-657.)、拟南芥（KilbyNJ，DaviesGJ，SnaithMR，MurrayJAH1995FLP recombinaseintransgenicplants:constitutiveactivityinstablytransformed tobaccoandgenerationofmarkedcellclonesinArabidopsis.PlantJ8 :637-652.) 等植物中进行了广泛的验证。
[0004] 为了提高植物转基因安全性，可利用FLP/Frt位点特异性重组系统删除植物基因 组中的外源选择标记基因和报告基因。当两个Frt位点在同一DNA分子且方向相同时，FLP酶可将两个Frt位点间的基因删除。人们利用FLP/Frt重组系统已成功在烟草中删除了抗 除草剂的乙酰乳酸合成酶als基因（单晓映，李蓓，张举仁2006利用FLP/frt重组系统产 生无选择标记的转基因烟草植株.生物工程学报，22 :744-750.)、删除了gus报告基因及 发状根形成rolC基因（GidoniD，BarM，GilboaN2001FLP/FRT_mediatedrestoration of normal phenotypes and clonal sectors formation in rolC transgenic tobacco. Transgenic ResearchlO:317-328.)〇
[0005] 除了利用FLP/Frt重组系统删除植物外源基因外，有时需要利用该系统进行外源 基因在受体植物基因组中进行定向叠加，达到在特定位点转化多基因的目的，此时，就需要 构建含单个Frt位点的载体。单个野生型Frt位点全长为48bp，FLP重组酶可与Frt位 点三个重复序列结合（FutcherAB1988The2microncircleplasmidofSaccharomyces cerevisiae.Yeast4 :27-40.)。已有充分的实验证据表明，Frt位点只有8bp的间隔序列 及其两侧两个反向重复序列时，Frt位点介导的重组效率没有明显的改变，甚至当一个或两 个反向重复远离间隔序列的一端缺失3bp序列时依然具有几乎同样的重组效率（Senecoff JF，BrucknerRC，CoxMM1985TheFLPrecombinaseoftheyeast2_micronplasmid： characterizationofitsrecombinationsite.Proc.Natl.Acad.Sci. 82 :7270-7274.)〇 据此，有学者已创建了截短的Frt位点，该位点长度39bp，包含I段8bp间隔序列、2段13bp 反向重复序列及与之相邻的5bp保护序列（李蓓，单晓映，尹小燕，张举仁2006单子叶植物 的FLP/frt位点特异性重组系统的构建.山东大学学报（理学版）41:149-156.)。本发明 设计的frt位点包括1段Sbp间隔序列、1段Ilbp重复序列、1段13bp反向重复序列及与 之相邻的3bp保护序列，Ilbp重复序列远离间隔序列的一端去掉了 2bp的GA碱基，这样的 Frt位点具有同样的重组功能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是在于提供了一种可用于基因重组或基因叠加的含单个缩减的Frt 位点的表达载体，该载体含有无启动子的绿色荧光蛋白（GFP)及可表达的(6-葡糖醛酸酶 (GUS)报告基因，此发明为未来进行植物多基因的遗传转化、定向重组或叠加奠定了基础。
[0007] 本发明的另一个目的是在于提供了 一种可用于基因重组或基因叠加的 pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos载体的构建方法，方法简便易行，试验操作方便。
[0008] 本发明的再一个目的是在于提供了pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos表达载体 在油菜中的转化方法和应用。
[0009] -种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用，包括以下步骤：
[0010] 质粒PBI-GFP的构建：利用BamHI和SacI内切酶切除PBI121载体中的⑶S基因， 同时在GFP两端加上BamHI和SacI酶切位点，再将GFP插入pBI121载体构建成pBI-GFP 载体；
[0011] DNA片段Frt-GFP-Tnos的获得：以Frtm-HindIII-GFP(5'-TGCAAGCTT AGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3' ）和 Tnos-HindIII-3'（5'-TGCAAGCTTCGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3'）为一对引物，利用 LA-Taq酶扩增pBI-GFP，由于引物Frtm-HindIII-GFP含有Frt位点，通过PCR将Frt位点 加在GFP-Tnos之前，获得Frt-GFP-Tnos片段。frtm代表了一种缩减的Frt位点，此位点只 包含了核心序列，具有完整Frt位点的作用；
[0012] 质粒pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos的构建：将DNA片段Frt-GFP-Tnos插入 PBI121载体的HindIII位点，构建含有Frt特异性重组位点的表达载体T18，T18的结构为 pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos。
[0013] 本发明的有益效果：本发明方法易行，操作方便，该载体在转基因中的应用。
【附图说明】
[0014] 为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明描述中所需要使用的附图 作简单地介绍。
[0015] 图 1 片段Frt-GFP-Tnos的获得，
[0016] 图2表达载体T18和T20克隆的筛选，
[0017] 图3阳性克隆的酶切鉴定，
[0018] 图4Frt-GFP-Tnos片段在pBI121载体中的插入方向，
[0019] 图5表达载体T18质粒图谱，
[0020] 图6T18转基因植株的PCR检测，其中M:DL2000Marker;1-7 :转基因植株；8 :质粒 阳性对照，
[0021] 图7frt位点重组功能验证。
【具体实施方式】
[0022] 1材料与方法
[0023] I. 1试验材料
[0024] I.I. 1供试油菜品种
[0025] 甘蓝型油菜品种中油821，该品种油菜及其转基因植株种植于中国农业科学院油 料作物研究所网室。
[0026] I. 1. 2 菌株
[0027] 大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5a、农杆菌菌株EHA105及LBA4404由本实验室 保存。
[0028] I.L3 载体
[0029] pMD18-T载体；
[0030] pBI121，pBI-GFP载体。
[0031] 1.1. 4主要试剂
[0032] dNTP、TaqDNA聚合酶和LA-Taq酶；
[0033] 限制性内切酶；
[0034] T4-DNA连接酶；
[0035] CTAB等；
[0036] 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）；
[0037]PCR引物；
[0038] 测序；
[0039] 文中提及的其余试剂均为国产分析纯产品。
[0040] MS培养基配方：
[0041 ]
[0042] 以上溶液均配成IOOX的母液。
[0043]筛选培养基：MS+3mg/L6_BA+0.lmg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar+13mg/L卡 那霉素。
[0044] 生根培养基：MS+0. 2mg/LNAA+400