0? 5yLCIAP酶
[0122] 37°C，30min后电泳回收，溶于 5yLCldH2O
[0123] 2.I. 3pT19 质粒中Frt-GFP-Tnos片段与pBI121 载体连接
[0124] 连接体系
[0125]
[0126]连接产物5yL电转Ep1300感受态，后37 °C复苏Ih，涂板KLB平板
[0127] 2.I. 4pT19质粒片段与pBI121载体连接阳性克隆的检测
[0128] 用引物GFPl和GFP2做PCR，结果有六个阳性克隆，它们分别是：8,9,10,18,19, 20 号克隆（图2)。
[0129] 提取8,9,10,18,19, 20克隆质粒用HindIII酶切，最后一个泳道是pBI121质粒用 HindIII酶切（图 3)
[0130] 结果说明这六个克隆都是pT19质粒片段与pBI121连接的阳性克隆
[0131] 2.I. 5pT19片段（Frt-GFP-Tnos)连入pBI121载体中的方向确定
[0132] 分别用两对引物扩增确定方向
[0133]AGFPl与 35S-3'（5' -GTCCCCCGTGITCTCTCCAAATG-3'）扩增
[0134]那么应该是Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos(正向）
[0135]BGFP2 与 35S-3' 扩增
[0136]那么应该是Tnos-GFP-Frt-35S-GUS-Tnos(反向）
[0137] 结果说明8(正向），9(正向），10(反向），18(正向），19(正向），20(反 向）。其中18号质粒转农杆菌EHA105用于转基因并命名为T18,T18的结构是 Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos(图 5) 〇
[0138] 2. 2T18转基因植株的PCR检测
[0139] 按照标准的转基因程序，以13mg/L的卡那霉素为筛选压力，15mg/L的卡那霉素为 生根筛选压力进行油菜的转基因，以NPTII基因为PCR筛选序列，进行筛选，获得4株阳性 苗（图6)。
[0140] 2. 3Frt特异性重组位点重组功能的鉴定
[0141] 实验结果表明：T18载体转基因植株与另一带有frt位点pWY86载体（YuWC，Lamb JC,HanFP,BirchlerJA2006Telomere_mediatedchromosomaltruncationinmaize. Proc.Natl.Acad.Sci. 103(46) :17331-17336.)的转基因植株杂交，绿色荧光蛋白正常表 达（图7)，表明frt位点发生了重组，T18载体具有正常的重组功能。
【主权项】
1. 一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 质粒pBI-GFP的构建：利用BamHI和SacI内切酶切除pBI121载体中的⑶S基因，同时 在GFP两端加上BamHI和SacI酶切位点，再将GFP插入pBI121载体构建成pBI-GFP载体；DNA片段Frt-GFP-Tnos的获得：以Frtm-HindIII-GFP(5'-TGCAAGCTT AGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3' ）和 Tnos-HindIII-3'（5'-TGCAAGCTTCGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3'）为一对引物，利用 LA-Taq酶扩增pBI-GFP，由于引物Frtm-HindIII-GFP含有Frt位点，通过PCR将Frt位点 加在GFP-Tnos之前，获得Frt-GFP-Tnos片段。Frtm代表了一种缩减的Frt位点，此位点只 包含了核心序列，具有完整Frt位点的作用； 质粒pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos的构建：将DNA片段Frt-GFP-Tnos插入pBI121 载体的Hindlll位点，构建含有Frt特异性重组位点的表达载体T18，T18的结构为pBI-Fr t-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos。2. 根据权利要求1所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在 于，还包括以下步骤： 第一步：MS培养基配方：以上溶液均配成100X的母液； 第二步： 筛选培养基：MS+3mg/L6_BA+0.lmg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar+13mg/L卡那霉 素； 生根培养基：MS+0. 2mg/LNAA+400mg/LCar+15mg/L卡那霉素； YEB培养基：牛肉膏（5g/L)，酵母抽提物（lg/L)，蛋白胨（5g/L)，蔗糖（5g/L)，MgS04(2mmol/L)pH7. 2,固体培养基含琼脂 15g/L; LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7. 0,再补足水至1L，固 体培养基含琼脂15g/L; 第三步：质粒DNA的酶切及其产物的纯化； 第四步：DNA的连接； 第五步：连接产物的重组子鉴定。3. 根据权利要求1所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在 于，所述质粒DNA的酶切及其产物的纯化，包括以下步骤： 取上述质粒DNA1. 0-2. 0yg，加入相应酶的10XBuffer2. 0y1，最后加入相应的限制 性内切酶，混匀酶切反应体系，37°C酶切2-4小时； 在1%的琼脂糖凝胶上电泳，分离片段； 凝胶成像照相后，紫外光下切割目的片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的片段； 取2y1在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，检测回收目的片段大小和浓度。4. 根据权利要求1所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在 于，所述DNA的连接，包括以下步骤： 按外源片段和载体比为1 : 1-10 : 1的量，加入相应量的片段。取回收的目的片段 20-50ng，进行连接； 加入 10XT4LigationBufferl. 0y1，3UT4DNALigase(Promega)，总体积不超过10yl； 连接反应程序：l〇°C3分钟；从10°C经历3分钟升至16°C;16°C3分钟；18°C1分钟； 17个循环，后65°C5分钟灭活连接酶； 结束后将反应液取5y1至透析膜上加无菌水于4°C透析20分钟，取连接产物和20y1 感受态细胞混合，进行电激转化。参数2KQ，330yF，330-350V; 电激后将菌体转入lmlS0C中，37°C200rpm培养50分钟；后铺板于含抗生素的LB培 养皿上。5. 根据权利要求1所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在 于，所述连接产物的重组子鉴定，包括以下步骤： 挑取单菌落于相应的抗生素LB中，摇菌37°C过夜培养。 采用碱裂解法提取质粒。 取上述质粒DNA1. 0-2. 0yg，加入相应酶的10XBuffer2. 0y1，最后加入相应的限制 性内切酶，混匀酶切反应体系，37°C酶切2-4小时。 在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检测分离片段大小。6. -种只有35bpfrt位点序列的重组载体的应用，其特征在于，包括以下步骤： 第一步：无菌苗的获得，种子用75%的酒精表面消毒30s，用无菌水冲洗2-3次，再用 2%的次氯酸钠消毒12-14min，用无菌水清洗5-6次，然后接种于MS固体培养基，在25°C， 光照16h条件下培养成苗，苗龄3-4d的子叶柄和下胚轴切段用于转化试验； 第二步：根癌农杆菌的活化，将_80°C保存的含构建好质粒的农杆菌菌液解冻，涂于含 有抗生素的YEB固体培养基28°C暗培养。2d后挑取单菌落于含有抗生素的YEB液体培养 基，在28°C，转速200r/min摇床上培养至0D600值为0. 6-1. 0备用； 第三步：根癌农杆菌的培养及转化，离心收集活化的农杆菌（5000r/min，8min)，用MS+lmg/L2,4-D+500mg/LMES+200ymol/LAS重悬培养液稀释至 0D600 值为 0? 2 左右用于 浸染；将切好的子叶柄与下胚轴于农杆菌浸染液中浸泡8min，其间不断振荡以均匀浸染； 于MS+lmg/L2,4-D+500mg/LMES+200ymol/LAS中暗培养 2d，转入MS+3mg/L6-BA+0.lmg/ LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar延迟筛选培养基中培养5-7d，25°C，光照16h。再转入 MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar+筛选抗生素的筛选培养基中，外 植体在上述培养基中，每隔20d用原培养基（筛选培养基）继代培养一次。待分化出绿 色小芽后转入新鲜培养基（筛选培养基）中培养，待分化出的绿芽长到3cm左右时，移入 MS+0. 2mg/LNAA+400mg/LCar+筛选抗生素的生根培养基中生根。7. 根据权利要求5所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体的应用，其特征在于， 还包括以下步骤：阳性苗的PCR快速检测， 称取约50mg的叶片，用70%的乙醇擦洗叶片，放入Eppendorf管中，用钻头研磨； 加入600y1DNA提取液，混匀，室温放置lh; DNA提取液包括：12000rpm离心lOmin，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的酸/氯仿 (1 : 1V/V)，混匀； 12000rpm离心5min，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，放置 lOmin； 12000rpm离心 5min; 弃上清，沉淀用70 %的乙醇洗涤一次； 沉淀干燥后用20y1TE(pH7. 5)溶解。以0. 5y1为模板进行PCR扩增筛选阳性植株。8. -种只有35bpfrt位点序列的重组载体，其特征在于，其关键序列为SEQIDNO. 1所 示的核苷酸序列。
【专利摘要】本发明公开了一种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用，即一种含有截短的单个Frt特异性重组位点的表达载体的构建方法和应用，其特征序列为SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，其构建方法步骤为：A.质粒pBI-GFP的构建；B.DNA片段Frt-GFP-Tnos的获得；C.质粒pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos的构建。本发明方法简单易行，操作方便，该载体在多基因转化方面具有应用价值和前景。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/66, C12N15/84
【公开号】CN105087639
【申请号】CN201410189584
【发明人】魏文辉, 李晨
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月7日