一种新的农杆菌介导的大白菜原位转基因方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及农杆菌介导的大白菜原位转基因方法。
【背景技术】
[0002] 1、大白菜CSrawica 是十字花科芸薹属CSrawica)中最 重要的蔬菜作物之一，是我国栽培面积最大、分布最广、人们普遍喜爱的蔬菜，被称为"当家 菜"。长期以来，我国大白菜主要是通过杂交育种进行品种改良。但传统的杂交育种方法， 存在育种年限长、成本高、亲本自交多代生活力易退化等诸多弊端，随着组织培养和DNA重 组技术的建立和不断完善，转基因技术已经成为改良农艺性状，解决农业生产难题的重要 手段。目前以农杆菌介导的转化方法主要有借助细胞组织培养技术的离体转化和直接在植 株上进行的原位渗入转化，例如花粉管通道法、真空渗入法等。
[0003] 目前，大白菜遗传转化最常使用的方法仍是利用普通的组培方式进行的农杆菌介 导法，即将要转化的植株的子叶等外植体作为转化受体在预培养基上培养生长，然后浸入 携带外源基因的农杆菌菌液中3~5min，在无菌滤纸上吸干菌液。首先，被浸染的外植体 在共培养基上培养一定的时间，以确保外源基因充分整合到染色体上；其次，被浸染的外植 体转移至恢复培养基，恢复培养基内含有一定浓度的抑制细菌生长的抗生素(有氨苄青霉 素、羧苄青霉素、利福平等）；最后，外植体被转移至含有一定浓度选择性抗生素的选择培养 基，筛选抗性芽，诱导生根，再生植株，经抗性分子鉴定获得转基因植株。近年来，大白菜转 基因研究随着其高频植株再生体系的建立和不断完善取得了显著进展。例如朱常香等、杨 广东等、王关林等、王洋等、张艳萍等、杨广东等分别将抗芜菁花叶病毒基因、修饰豇豆胰蛋 白酶抑制剂基因、抗菌肽基因、白细胞介素一 2基因、硝酸还原酶基因、雪花莲凝集素基因 GNA等用农杆菌介导法导人大白菜基因组，获得了转基因植株。
[0004] 据近几年研究报道，以农杆菌介导的大白菜遗传转化所使用的受体主要是无菌苗 的子叶或下胚轴，都是体细胞组织，具有两套染色体，外源基因同时插入同源染色体相同座 位的可能性极小，因而转化植株常常是杂合的，后代会发生分离。曹鸣庆等以小孢子作为遗 传转化受体，得到了抗除草剂转基因植株。因为小孢子同时具备了单倍体和单细胞两个特 性，转化体经加倍后即可成为纯合的二倍体。
[0005] 但是，由于大白菜组织培养难度较大，再生体系较难建立，一定程度上制约了转基 因技术在大白菜育种中的应用，因此，寻求不依赖于组织培养途径的转化方法，是许多从事 基因工程研究的研究者非常关注的事情。花粉管通道法是一种以生殖细胞作为外源DNA的 受体细胞，借助开花植物复杂的有性生殖过程，获得转基因植株的方法。其原理主要是授粉 后使外源DNA能沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合 子或早期胚胎细胞。据统计，外源DNA直接导入植物技术已相继在近30种作物上获得成功， 在水稻、小麦等经济作物上的应用例子比较多，而在蔬菜育种上的应用相对少一些，尤其对 一些蔬菜小品种报道不多。例如王雷等人通过花粉管通道法介导il-4基因转化大白菜，"哈 白二号"大白菜在花期授粉后24h左右进行转化，转化率达1. 15%。
[0006] 原位渗入转化法最早获得成功是Feldmann和Marks利用农杆菌侵染刚刚萌发的 种子，从其后代种子中筛选出了抗性株，并通过分子杂交进行了验证。而真空渗入转化法 作为原位渗入转化的一种，它是由Bechtold等将植物病理学中用来辅助植物病毒进入植 株的方法，应用到了拟南芥植株的农杆菌基因转化上，其转化频率较种子转化提高了 3~4 倍。该方法避开了组织培养的过程，以生长中的植株作为转化受体，从后代种子中直接筛选 抗性株，为植物的转基因工作开辟了新的途径。但遗憾的是目前这种方法除在拟南芥中被 广泛应用外，其他植物中仅在不结球白菜、苜蓿中有成功转化的报道。曹鸣庆等将不结球白 菜利用真空渗入法转化获得了转基因白菜。刘凡等利用农杆菌介导的真空渗入转化法将马 铃薯蛋白酶抑制剂基因/i)导人不结球白菜"49菜心"中，获得抗虫性材料。
[0007] 尽管大白菜转基因技术取得一些进展，但由于离体转化比较困难，大白菜农杆菌 介导的离体转基因方法受到制约，花粉管通道法和真空渗入法仅在不结球白菜上试验成 功，在接球大白菜上未见报道，且这些方法也存在一些弊端，实践上迫切需要发展一些更高 效、简易、快捷、重复性好的技术。
[0008] 本发明的植物原位转基因方法（inplantatransformation)是一种更加简便、 快速、可靠，且无需经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的新的基因转化方法，其根本 特点就在于它不需要组织或细胞培养手段，也无需抽真空而达到植物在活体（invivo)而 非离体（vitro)状态下的转化。目前，这种方法的应用还仅局限于拟南芥，本方法为寻找芸 薹属作物乃至十字花科作物高效遗传转化的非组织培养方法提供借鉴，意义重大。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种新的大白菜原位转基因途径，不需要组织培养和复杂的 操作而直接获得转基因植株的方法，以克服现有技术的不足。
[0010] 本发明是这样实现的： (1)配制农杆菌浸染液：从平板上挑取含有待转基因的单菌落，接种到含筛选抗生素的YEB液体培养基（pH7. 0)中，28°C、225r/min的条件下培养至OD6m=O. 6~0. 8。取800ML 菌液稀释到50mL无抗生素的YEB液体培养基中，相同条件下培养至OD6tw=O. 6~0. 8时， 4000r/min离心5min，沉淀物用50mL液体MS培养基将菌体重悬。
[0011] (2)大白菜原位转基因方法：大白菜于田间正常生长至开花始期，去除已开的花， 保留花蕾，用镊子轻轻将花蕾剥开小口，将花序全部浸泡在农杆菌浸染液里2~4min。正常 管理，采收种子。
[0012] (3)大白菜转化后代的抗性鉴定：将收获的大白菜种子播种于含抗生素的培养基 MS+lmg/LBA上，挑选具有抗性的幼苗进行转化植株的分子检测。
[0013] (4)大白菜转化植株的分子检测：采集具有抗性的大白菜幼嫩叶片，用常规的 CTAB法提取叶片DNA进行PCR检测。取PCR反应产物IOul，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳， 观察如有待转基因的条带，则说明是转基因阳性植株，转化成功。
[0014] 由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明有7大优点： (1)针对由于白菜携带不易再生的AA基因组型，白菜难分化这一特点，本方法不需要 外植体的再生系统，这对组织培养时不定芽发生困难的大白菜基因型的转基因研究具有较 大的应用价值，在其他作物涉及植株再生的转基因方法遇到困难时，亦具有很好的应用前 景。
[0015] (2)简化和缩短转基因育种过程，直接得到转化种子，无须进行繁琐的组织培养， 避免了组培过程中容易污染导致转化失败，也免除了从离体原生质到再生植株漫长的人工 培养过程，还减少了基因型的影响。
[0016] (3)操作简便、快速、高效、成本低、易于掌握，无需昂贵的仪器设备和化学药品，研 究人员可直接在田间操作。
[0017] (4)具备基因工程的先进性，不仅可以导入供体的总DNA，也可是部分DNA片段或 目的基因，导入的DNA易于整合，被转基因所控制的性状在受体植株中易于稳定。
[0018] (5)在转基因表达载体构建中，有时可省略抗生素标记基因，因而在转基因产品 中，将可能不含有抗生素表达，安全性会更好。
[0019] (6)保留了常规育种的基本特点（可直接按照育种要求选择转化后代）。
[0020] (7)在现有技术中，国内外从没有将大白菜花蕾直接浸泡在含待转基因的农杆菌 浸染液里，在活体状态下原位转化而直接获得大白菜转化种子。
[0021] 本发明与现有技术农杆菌介导离体转化法、花粉管通道法及真空渗入法相比，有 以下3大不同点： (1)常用的由农杆菌介导的离体转化方法需经过以下步骤：一、选择植物材料进行无菌 培养，培养子叶、下胚轴、小孢子等组织或器官作为转化受体(外痔提）；二、建立高频再生体 系；三、材料选择压的确定；四、农杆菌的活化；五、受体材料的预培养；六、感染材料和共培 养；七、抑菌培养；八、选择培养；九、转基因植株鉴定；十、转基因后代的遗传稳定性分析。 该方法的缺点是：_大白菜是芸薹属中最难再生的一类作物，由于白菜具有AA基因组，与 芸薹属其他具有BB和CC基因组的植物相比，其不定芽和植株再生比较难；賴大白菜组织培 养及转化再生能力对基因型依赖性比较强，不同的基因型其再生率和转化难易程度差异很 大，所以对于特定的大白菜材料，需要进行再生和转化体系的优化; 1i不同的抑菌抗生素和 转化的农杆菌菌株对外植体的分化有一定的影响；響有些品种存在着可再生细胞和转化感 受态细胞部位不一致的问题，造成逃逸体、嵌合体、转化率低下等；有的品种农杆菌与受 感染细胞间易产生过敏性反应，导致感染部位的褐化和坏死；?细胞脱分化和再分化中有 可能产生体细胞变异以及转基因植株的育性降低或丧失，这有可能干扰转基因植株的分析 及利用。
[0022] 本发明的转基因过程与上述不同，是直接将大白菜花蕾浸泡在含待转基因的农杆 菌浸染液里，直接获得大白菜转化种子，不需组织培养过程，简单易行，大大节约了时间，缩 短了转化进程，且避免了植物组织培养过程中可能产生的体细胞变异及基因型依赖性等上 述6