一种产二甲基二硫醚(dmds)的恶臭马赛菌及其应用
【技术领域】：
[0001 ] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能产二甲基二硫醚（Dimethyl disulfide，DMDS)的细菌新物种一恶臭马赛菌及其应用。
【背景技术】：
[0002] 土壤熏蒸剂能够有效防治土传病害，在农业生产中的被广泛应用。其中，溴甲烷在 过去的几十年是最常用的熏蒸剂，但由于其破坏大气臭氧层，严重危害到地球环境和人类 健康，在《蒙特利尔议定书》中被列为限控物质，2015年以后将在世界范围内被禁止使用。 二甲基二硫醚（DMDS)对害虫具有触杀和胃毒作用，对作物具有一定渗透性，但无内吸传导 作用，杀虫广谱，作用迅速，是联合国溴甲烷技术选择委员会提出的一种新型的土壤熏蒸剂 替代品。研究表明二甲基二硫醚（DMDS)具有杀灭土壤线虫、土壤病原真菌、杂草及地下害 虫的效果，对土壤中的线虫及有害真菌均具有较强的防治效果，作为新型的土壤熏蒸剂得 到了广泛的认可。目前，关于产二甲基二硫醚的微生物及其在土壤病虫害防治应用中的研 究尚未见报道。
【发明内容】
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[0003] 本发明的第一个目的是提供一种能够产二甲基二硫醚（DMDS)的微生物新物种一 恶臭马赛菌（Massiliaputida)6NM_7。该菌株于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo: 11070。
[0004] 本发明的恶臭马赛菌（Massiliaputida)6NM_7能产生二甲基二硫醚，而二甲基二 硫醚是一种极为重要的防治土传病害的新型土壤熏蒸剂的主要成分。
[0005] 因此，本发明的第二个目的是提供恶臭马赛菌（Massiliaputida)6NM_7在制备二 甲基二硫醚中的应用。
[0006] 本发明的第三个目的是提供恶臭马赛菌（Massiliaputida)6NM-7在制备土壤熏 蒸剂中的应用。
[0007] 本发明的恶臭马赛菌（Massiliaputida)6NM_7,其是一种微生物新种，能产二甲 基二硫醚（DMDS)，在防治土传病害和研发新型土壤熏蒸剂上具有重要的应用价值。
[0008] 本发明的恶臭马赛菌（Massiliaputida) 6NM-7已于2015年7月14日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo: 11070。
【附图说明】：
[0009] 图1为本发明的恶臭马赛菌6NM-7的透射电子显微镜照片；
[0010]图2为本发明的恶臭马赛菌6NM-7基于其16SrRNA基因序列构建的NJ系统发育 树；
[0011] 图3为本发明的恶臭马赛菌6NM-7产二甲基二硫醚（DMDS)的GC-MS分析，图3A 为恶臭气体的GC分析，图3B为4. 6min的组份经过质谱分析为二甲基二硫醚（DMDS)。
【具体实施方式】：
[0012] 以下实施例是对本发明做进一步的说明，而不是对本发明的限制。
[0013] 实施例1:
[0014] 一、恶臭马赛菌6NM-7的分离。
[0015] 本发明的恶臭马赛菌6NM-7是从江西大余县钨矿区采集的矿砂样品中分离培养 得到的。具体分离方法为：取l〇g矿砂样品于装有90mL无菌水的三角瓶中，180rpm摇床振 荡过夜，取上清液lmL按10倍梯度逐级稀释，分别将0.lmL不同梯度的稀释液涂布于R2A 培养基上。30°C倒置培养7天。挑取不同形态的菌落过程中获得菌株6NM-7(恶臭马赛菌 (Massiliaputida)6NM_7)。
[0016] 所述的R2A培养基配方为：酵母提取物0. 5g,蛋白胨0. 5g,酸水解干酪素0. 5g,葡 萄糖 〇? 5g，可溶性淀粉 0? 5g，K2HP040 . 3g，MgS04 ? 7H20 0? 05g，丙酮酸钠 0? 3g，琼脂粉 20g， 双蒸水1000mL，pH7. 0~7. 4。将上述组份混合均匀后，灭菌备用。
[0017] 二、恶臭马赛菌6NM-7的鉴定
[0018] 1.表型特征：将菌株6NM-7采用三区划线接种于R2A培养基上，置于30°C培养箱 培养3天，取出观察菌落特征。细胞形态观察（图1)、革兰氏染色、淀粉水解、运动性实验、 接触酶等测定参见《常见细菌鉴定手册》。氧化酶、0 _半乳糖苷酶、尿酶、精氨酸双水解酶、 葡萄糖发酵、吲哚、硝酸盐还原、水解七叶灵和明胶等采用API20NE试剂条。恶臭马赛菌 6NM-7对不同碳氮源的利用情况则分别采用了API20NE和BiologGNIII，操作按照说明书 进行。
[0019] 形态特征：菌株6NM-7在R2A平板上30°C培养72h后菌落呈灰白色，圆形，边缘规 则，表面粗糙，不透明（图1)，菌落散发出强烈的农药气味。细胞呈杆状，单端有鞭毛，运动， 无芽孢，好氧生长。
[0020] 生理生化特征：菌株6NM-7为革兰氏染色为阴性，氧化酶、0 -半乳糖苷酶、尿酶、 精氨酸双水解酶、葡萄糖发酵、吲哚、硝酸盐还原、水解七叶灵均为阴性，接触酶、淀粉水解 和明胶水解均为阳性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄 糖酸盐、海藻糖、蔗糖和D-半乳糖，但不能利用已二酸、苹果酸、苯乙酸、柠檬酸、癸酸、甘露 醇、乳糖、0 _甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、3-甲酰葡萄糖、D-岩藻糖和肌苷。
[0021] 将本发明的菌株6NM-7与其同源性最高的马赛菌属已发表模式菌株进行了生理 生化特征的比较，结果如表1所示。
[0022] 表1菌株6NM-7与同源性最高的模式菌株微生物学特性比较
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[0025]注 1 :" 1 " 表不Massiliaputida6NM-7 ;"2" 表不M.norwichensisLMG281641; "3" 表示M.kyonggiensisKACC17471T;"4" 表示M.niastensisKACC12599T;"5" 表 示M.tieshanensisKACC14940T;"6" 表示M.haematophilaCCUG38318T;"7" 表示 M.namucuoensisCGMCC1.11014T;"8" 表示M.aerilataKACC12505 T.
[0026] 注2 :" + "表示阳性；表示阴性；"w"表示弱阳性；"ND"表示未测定。
[0027] 2.遗传发育分析：采用细菌通用引物27F和1492R进行菌株6NM-7的16SrRNA基 因的PCR扩增，将获得的PCR产物经过切胶回收后克隆测序，获得其序列信息（其核苷酸序 列如SEQIDNO. 1所示），将序列信息与NCBI数据库进行Blast比对，得到与其相似度最高 的已发表模式种信息。采用生物学软件MEGA5构建菌株6NM-7的NJ系统发育树，如图2所 不。
[0028] 16SrRNA基因扩增和序列比对发现与Massiliaputida6NM-7(菌株6NM-7)最大 相似度模式菌株为MassilianorwichensisLMG28164T(98.7%)，Massiliakyonggiensis KACC17471T(98. 4 %),MassilianiastensisKACC12599T(97.8 %),Massilia tieshanensisKACC14940T(97. 3 %),MassiliahaematophilaCCUG 38318T(97.2 %)，MassilianamucuonensisCGMCC1.11014T(97.1 % )和Massilia aerilataKACC12505T(97.1%)。遗传发育分析发现该菌株属于马赛菌属（Massilia)， 在进化树上与除MassiliahaematophilaCCUG383187和Massiliatieshanensis KACC149401的其他最大相似度模式菌株聚成一簇。DNA-DNA杂交结果显示Massilia putida6NM-7 与MassilianorwichensisLMG28164T,Massi1iakyonggiensis KACC17471T,MassilianiastensisKACC125991,MassiliatieshanensisKACC 14940t,MassiliahaematophilaCCUG38318'MassilianamucuonensisCGMCC1. 110141 和MassiliaaerilataKACC125051杂交率分别为：59.7±4.8 %、48.1±3.0 %、 42. 3±2. 0%、19. 8±3. 7 %、45. 0±1. 2 %、20. 3±1. 8 % 和 24. 3±1. 2 %，DNA-DNA杂交结 果均小于70%，即小于国际公认的新种临界值（Wayneetal.，1987)，这表明Massilia putida6NM-7(菌株6NM-7)可能为马赛菌属的一个新物种。
[0029] 3.化学分类特征：DNA的G+C含量测定方法Mesbahetal. (1989)。DNA-DNA杂交 采用Lambda35紫外可见分光光度计测定，方法参照DeLeyetal. (1970)。脂肪酸提取和 测定采用MIDI公司的标准方法（Sasser, 1990)。
[0030] 将本发明的Massiliaputida6NM-7与其同源性最高的马赛菌属已发表模式种进 行了脂肪酸组成成分的比较，结果如表2所示。
[0031] 表2Massiliaputida6NM-7与同源性最高的模式菌株脂肪酸组成比较（％ )
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[0033]
[0034]注 1 :" 1 " 表不Massiliaputida6NM-7 ;"2" 表不M.norwichensisLMG281641; "3" 表示M.kyonggiensisKACC17471T;"4" 表示M.niastensisKACC12599T;"5" 表 示M.tieshanensisKACC14940T;"6" 表示M.haematophilaCCUG38318T;"7" 表示 M.namucuoensisCGMCC1.11014T;"8" 表示M.aerilataKACC12505 T.
[0035]注 2:"Summedfeature3"表示C16:1 〇7c和 / 或C16:1 〇6c;"ND"表示未检测到 该组分；"〈1"表示该组份含量小于脂肪酸总体含量的1% ;
[0036] 综合表型特征、遗传发育分析、化学分类特征，本发明的菌株6NM-7是马赛菌属的 一个新物种，将其命名为恶臭马赛菌（Massiliaputida)6NM-7,已于2015年7月14日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo: 11070。
[0037] 三、恶臭马赛菌6NM-7产二甲基二硫醚（DMDS)的测定：
[0038] 挑取本发明的恶臭马赛菌6NM-7的单菌落，接种至200mL的液体R2A培养基中， 180rpm摇床30°C振荡培养3天。采用一次性注射器吸取三角瓶中的恶臭气体，通过气相色 谱质谱仪（GC-MS)进行分析。测试结果发现农药气味的恶臭气体主要成分为二甲基二硫醚 (DMDS)，如图3所示。图3A为恶臭气体的GC分析，在4. 6min和6. 8min分别产生了两个峰。 图3B为4. 6min的组份经过质谱分析为二甲基二硫醚（DMDS)。6. 8min为柱流失成分。
[0039] 由于二甲基二硫醚是一种极为重要的新型土壤熏蒸剂，本发明提供的产二甲基二 硫醚（DMDS)的恶臭马赛菌6NM-7在防治土传病害和研发新型土壤熏蒸剂上具有重要的应 用价值。
【主权项】
1?恶臭马赛菌（Massilia putida)6NM-7,保藏编号为 CGMCC No:11070。2. 权利要求1所述的恶臭马赛菌（Massilia putida)6NM_7在制备二甲基二硫醚中的 应用。3. 权利要求1所述的恶臭马赛菌（Massilia putida)6NM-7在制备土壤熏蒸剂中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种恶臭马赛菌及其应用。本发明的恶臭马赛菌(Massilia？putida)6NM-7是一个微生物新物种，已于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC？No:11070。其能产二甲基二硫醚(DMDS)，在防治土传病害和研发新型土壤熏蒸剂上具有重要的应用价值。CGMCC No:1107020150714
【IPC分类】A01N25/18, A01P1/00, C12N1/20, C12R1/01, A01N63/00, A01P3/00, C12P11/00
【公开号】CN105112324
【申请号】CN201510497964
【发明人】冯广达, 朱红惠, 羊宋贞, 王永红, 李燕旋, 杨瑞恒
【申请人】广东省微生物研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月14日