专利名称：：二甲基二硫醚在微生物中用于甲硫氨酸生产的制作方法二甲基二硫醚在微生物中用于曱硫氨酸生产相关申请本申请要求2005年7月18日提交的标题为"二甲基二硫醚在微生物中用于甲硫氨酸生产"(UseofDimethylDisulfideforMethionineProductioninMicrorganisms)的美国临时专利申请号60/700,698和2005年9月1日提交的标题为"二甲基二硫醚在微生物中用于甲硫氨酸生产"的美国临时专利申请号60/713，卯7的优先权。本申请涉及2005年7月18日提交的标题为"使用芽孢杆菌il^J基因提高微生物中的甲硫氨酸产量，，(Useofa5""7/wsM^/GenetoImproveMethionineProductioninMicroorganisms)的美国临时专利申请号60/700,557和2005年9月1日提交的标题为"使用芽孢杆菌AfW/基因提高孩l生物中的甲硫氨酸产量"的美国临时专利申请号60/60/713,905。本申请还涉及2005年9月1日提交的标题为"产生甲硫氨酸的重组微生物"的美国临时专利申请号60/714，042和2005年7月18日提交的标题为"产生甲硫氨酸的重组微生物"的美国临时专利申请号60/700,699。将这些专利申请的完整内容都明确引入本文作为参考，所述内容包括说明书、权利要求书和摘要，以及其附图、表或者图。
背景技术：
：当前通过良好建立的化学方法以DL-甲硫氨酸外消旋混合物产生曱硫氨酸，所述方法涉及毒性的、危险的、易燃的、不稳定的和毒性物质或者中间体。用于甲硫氨酸的化学生产的原材料是丙烯醛、曱硫醇和氰化氩。甲硫氨酸的化学合成涉及甲硫醇和丙烯醛反应，产生中间体3-曱基巯基丙醛(MMP)。其他处理涉及将MMP与氰化氢反应形成5-(2-甲硫基乙基)乙内酰脲，其然后使用苛性剂如NaOH以及Na2C03、NBb和C02水解。随后，将DL-曱硫氨酸钠用硫酸和Na2C03中和以产生DL-甲硫氨酸、Na;jS04和co2。该方法与产生的甲疏氨酸的量相比产生过量的不使用的化合物，其造成经济和生态学挑战。用于曱硫氨酸生产的发酵方法通常基于用营养物，包括糖源，例如，糖，如葡萄糖、果糖或者蔗糖，氮源，例如，铵和硫源，例如，疏酸盐或者硫代硫酸盐，以及其他不必要的培养基组分培养微生物。该方法产生L-曱硫氨酸和作为副产物的生物量，使用没有毒性危险的、易燃的、不稳定的和/或有害的原材料。然而，为了生物(例如，微生物)从作为疏源的硫酸盐产生曱硫氨酸，硫原子必须首先被还原成硫化物。该过程是能量密集的，因此，对微生物输送比硫酸盐进一步还原的硫源将改善该过程。一种此类还原的硫源是硫代硫酸盐，其中两个硫原子的一个已经被还原。经还原的硫的另一来源是甲硫醇，其含有完全还原的硫原子。使用甲硫醇产生甲疏氨酸提供了两个优点。首先，如上文提到的，已经产生了硫原子。其次，提供了曱基，其可以潜在避免对甲硫氨酸生物合成通常需要的两种酶甲基四氢叶酸还原酶(MetF)和甲硫氨酸合酶(MetE和/或MetH)的需要。有文献报道公开一些微生物，如酿酒酵母(S"cc/ia/7附j;cMcei^v/s/fle)可以通过将曱石危醇与O曙乙酰基高丝氨^A应将甲硫醇直接掺入甲石克氨酸中(Yamagata，S.1971.丄祝oc/^柳.(Tokyo)70:1035)。在曱硫氨酸生产中使用曱硫醇的方法也公开在WO93/17112和WO2004/076659中。然而，使用甲硫醇产生甲硫氨酸也具有缺点。它是毒性的、爆炸性气体，容易在空气中氧化，并且是有毒的。产生曱硫氨酸的化学方法还使用甲硫醇作为底物之一，因此，工程师已经知道在工业规模处理该化合物。但是，不使用甲硫醇生产甲硫氨酸的改进方法将有很大益处。发明概述本发明涉及用于产生曱硫氨酸的改进方法(例如，微生物合成)。本发明人已经发现不同于甲硫醇的硫和/或甲基来源可以用于产生甲辟u氨酸。具体地，本发明人已经发现可以将二甲基二硫醚(DMDS)(也称作二甲二硫或者CHb-S-S-CH3)加入培养基并被微生物用作硫化物和甲基来源，避免对MetH/MetE和MetF活性的需要和还原硫酸盐以合成甲硫氨酸的需要。此外，本发明阐明具有失调的甲硫氨酸生物合成途径，例如失调的O-乙酰基高丝氨酸石克化氢解酶，和/或失调的高丝氨酸乙酰转移酶和/或失调的高丝氨酸脱氢酶的微生物可以使用曱基封端的硫醚化合物，例如硫和/或甲基来源，如二甲基二硫醚(DMDS)用于合成甲硫氨酸。此外，发明人发现积累O-乙酰基高丝氨酸的工程化的原养型菌林的甲硫氨酸产量通过加入DMDS而得到提高。因此，一方面，本发明描述了生产曱硫氨酸的方法，其包括在甲基封端的硫醚化合物，例如硫和/或甲基来源，如二甲基二硫醚(DMDS)的存在下培养敞生物，使得产生甲硫氨酸。在一个实施方案中，甲基封端的硫醚化合物，例如硫和/或曱基来源，如DMDS以0.02%或更高浓度存在于培养物中。在另一实施方案中，曱基封端的硫醚化合物，例如疏和/或甲基来源，如DMDS以0.06%或更高浓度存在于培养物中。在其他实施方案中，甲基封端的硫醚化合物，例如硫和/或曱基来源选自二甲基三硫(DMTS)或CH3-S-S-S-CH3、二曱基四硫(DMTTS)或CH3-S-S-S-S-CH3，或硫醚的更高分子量聚合物，其末端由甲基封端。本发明的另一方面描述了产生曱硫氨酸的方法，其包括在緩释甲基封端的硫醚递送系统，例如硫和/或甲基递送系统，例如二甲基二硫醚(DMDS)递送系统存在下培养产生甲硫氨酸的微生物，从而产生甲硫氨酸。在一个实施方案中，緩释甲基封端的硫醚递送系统，例如，緩释硫和/或甲基递送系统，例如，DMDS的緩释递送系统是AmberliteTMXAD4。在一个实施方案中，緩释递送系统以培养基中总共0.1。/o或更高水平释放DMDS。在再一个实施方案中，緩释递送系统以培养基中总共0.3%或更高水平释放DMDS。在一个实施方案中，緩释DMDS递送系统包含与水不溶混但是溶解DMDS的液体。在一个实施方案中，緩释甲基封端的硫醚递送系统，例如硫和/或甲基递送系统，例如DMDS的緩释递送系统包含选自动物油、矿物油、化学油、植物油、合成油、有机溶剂、氯碳化合物、氟碳化合物、氯氟碳化合物或者其组合的液体。在另一实施方案中，緩释甲基封端的硫醚递送系统，例如硫和/或曱基递送系统，例如DMDS的緩释递送系统包含与水不溶混但是溶解曱基封端的硫醚化合物，例如硫和/或甲基来源，例如DMDS的液体。在再一个实施方案中，緩释曱基封端的硫醚递送系统，例如硫和/或曱基递送系统，例如DMDS的緩释递送系统是甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源的緩慢受控的进料，例如緩慢受控的DMDS进料。在另一个实施方案中，緩释甲基封端的硫醚递送系统，例如硫和/或甲基递送系统，例如DMDS緩释递送系统是膜，其对于甲基封端的硫醚，例如硫和/或曱基来源，例如DMDS是可渗透的。在另一实施方案中，DMDS緩释系统递送气态的DMDS,例如，通过蒸发或者沸腾液体DMDS，或者通过例如在通向发酵容器的路上通过液体DMDS鼓空气或者氧气泡进行递送。在一个实施方案中，产生曱硫氨酸的微生物属于棒杆菌属(Cwy"W"cfei77i柳)。在另一实施方案中，产生曱硫氨酸的微生物是谷氨酸棒杆菌(Go;we6tfcfeWw附g/"to/m'cw附)。在再一个实施方案中，产生甲硫氨酸的微生物选自革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌或者相关的肠细菌)、革兰氏阳性细菌(例如，枯草芽孢杆菌(5fl"7/附sM&f7&)或者相关的芽孢杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母(S"cc^afw^cMce"Ww'ae)或者相关的酵母菌林)，和古细菌。在一个实施方案中，产生甲硫氨酸的微生物具有至少一种失调的甲硫氨酸生物合成酶。在另一实施方案中，所述微生物具有失调的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。在再一个实施方案中，产生甲硫氨酸的微生物具有至少两种失调的曱硫氨酸生物合成酶。在一个实施方案中，所述微生物具有失调的高丝氨酸乙酰转移酶和失调的高丝氨酸脱氢酶。在另一实施方案中，微生物具有失调的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和失调的高丝氨酸乙酰转移酶。本发明的另一方面描述了产生曱疏氨酸的方法，其包括在曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，例如，二曱基二疏醚(DMDS)的存在下培养具有失调的甲硫氨酸生物合成途径的微生物，从而产生甲硫氨酸。在一个实施方案中，所述孩支生物属于棒杆菌。在另一实施方案中，微生物是谷氨酸棒杆菌。在再一个实施方案中，所述微生物选自革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌或者相关的肠细菌)、革兰氏阳性细菌(例如，枯草芽孢杆菌(5fl"7/船sw^/fo)或者相关的芽孢杆菌)、酵母(例如，g良酒酵母(5Vicrc/^附^CMce/rWwVie)或者相关的酵母菌林)，和古细菌。在一个实施方案中，所述微生物具有失调的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。在另一实施方案中，所述微生物具有失调的高丝氨酸乙酰转移酶和失调的高丝氨酸脱氢酶。在再一实施方案中，微生物具有失调的O-乙酰基高丝氨酸硫化氩解酶和失调的高丝氨酸乙酰转移酶。本发明的再一方面描述了根据上述任一方法合成的产物。本发明的另一方面描述了用于在曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，例如，二甲基二硫醚(DMDS)的存在下产生甲硫氨酸的重组微生物，所述微生物具有失调的甲硫氨酸生物合成途径。在一个实施方案中，所迷微生物属于棒杆菌。在另一实施方案中，微生物是谷氨酸棒杆菌。在再一个实施方案中，所述微生物选自革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌或者相关的肠细菌)、革兰氏阳性细菌(例如，枯草芽孢杆菌(5fla7/肌SM6说&)或者相关的芽孢杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母Oyflcc/^iwf^c^cereWs/"e)或者相关的酵母菌林)，和古细菌。在一个实施方案中，所述微生物具有失调的O曙乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。在另一实施方案中，所述微生物具有失调的高丝氨酸乙酰转移酶和失调的高丝氨酸脱氬酶。在再一实施方案中，微生物具有失调的O-乙酰基高丝氨酸石克化氢解酶和失调的高丝氨酸乙酰转移酶。本发明的再一个方面描述了鉴定甲硫氨^A馈抗性的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和/或o-琥珀酰高丝氨酸硫化氩解酶和/或编码所述甲硫氨M馈抗性酶的基因(例如，突变基因或者等位基因)的方法。在一个实施方案中，本发明描述了鉴定抵抗甲硫氨酸反馈抑制的编码o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和/或o-琥珀酰高丝氨酸硫化氬解酶的突变等位基因的方法，其包括a)将依赖于DMDS与质粒编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氩解酶和/或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶以在无甲硫氨酸的培养基上生长的微生物与抑制所述微生物生长的甲硫氨酸类似物接触，b)选择所述微生物的抗所述类似物的突变变体，c)分离所述突变变体，其中所述抗性表型由所述质粒编码，和d)测定所述质粒的相关部分的DNA序列以鉴定突变质粒，该质粒在所述O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸石危化氢解酶的编码区中具有改变的序列。本发明还描述了通过该方法分离的新的突变的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶、编码所述突变酶的基因，以及含有所述突变酶的生物。附图简述图l是甲硫氨酸生物合成途径的图示。甲硫氨酸生物酶以粗体描绘并且它们对应的基因以斜体指出。图2是pH273载体的示意图。图3是pH373载体的示意图。图4是pH304载体的示意图。图5是pH399载体的示意图。图6是pH484载体的示意图。图7是pH491载体的示意图。图8A-8B是使用质粒H215,缺失w"F部分之前(8A)和之后(8B)，附WF区中谷氨酸棒杆菌染色体的结构示意图。图9是载体pOM86的示意图，该载体是设计用来用大观霉素抗性盒破坏谷氨酸棒杆菌附WF基因的质粒。图10是pH469载体的示意图。图11是pH300载体的示意图。发明详述本发明至少部分基于发现用于产生曱疏氨酸的改进方法(例如，微生物合成)。如本文所述的，通过化学方法产生甲硫氨酸当前使用有毒和危险的化学品，如甲硫醇作为硫源。已经发现危险和毒性较低的硫源可以用于甲硫氨酸的生物合成产生。具体地，本发明人已经发现甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，如二甲基二硫醚(DMDS)，也称作二曱二石危可以加入到培养基中并被微生物使用。如所附实施例中所述，谷氨酸棒杆菌的A附WF菌林或A附e&Aw^^菌林可以使用甲基封端的石克醚，例如硫和/或甲基来源，如二甲基二硫醚(DMDS)作为硫醚和甲基的来源，避免了为合成甲硫氨酸而对MetH/MetE和MetF活性的需要和对还原硫酸盐的需要。甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，如二甲基二硫醚用于产生甲硫氨酸提供了甲硫醇的多数优点但是没有其多数缺点。DMDS是甲硫醇的氧化的二硫醚二聚体，其是石油蒸馏工业的相对廉价的副产物。它在室温是液体，沸点为约109。C。DMDS难溶于水；如果以0.1。/。或更高浓度，尤其以0.3%或更高浓度加入到生长培养基，那么多数DMDS作为油保留在容器的底部或者侧面。此外，本发明阐明MetY(也称作MetZ;O-乙酰基-高丝氨酸硫化氬解酶)是将甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，如DMDS直接或间接掺入曱硫氨酸的酶，因为谷氨酸棒杆菌的Am^FA附e访菌抹可以使用甲基封端的硫醚，例如疏和/或甲基来源，如DMDS作为二硫醚和曱基两者的来源。此外，通过加入甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，如DMDS提高了积累O-乙酰基高丝氨酸的工程化原养型菌林的甲硫氨酸产量。因此，本发明提供了用于产生甲硫氨酸的方法和微生物。为了可以更容易地理解本发明，在本文首先定义一些术语。术语"甲硫氨酸生物合成途径"包括涉及在甲硫氨酸的形成和合成中利用的甲石克氨酸生物合成酶(例如，生物合成酶编码基因编码的多肽)、化合物(例如，前体、底物、中间物或产物)、辅因子等等的生物合成途径。术语"甲硫氨酸生物合成途径"包括导致微生物中甲硫氨酸的合成(例如，体内)的生物合成途径以及导致体外甲硫氨酸合成的生物合成途径。术语"甲硫氨酸生物合成酶"包括甲硫氨酸生物途径的化合物(例如，中间物或产物)形成中利用的任何酶。"甲硫氨酸生物合成酶"包括涉及例如"转硫作用途径"和"直接巯基化途径"、曱硫氨酸合成的替代途径的酶。例如，大肠杆菌利用转硫作用途径，而其他微生物如酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌和这些微生物的近亲已经发展了直接巯基化途径。尽管许多微生物使用转硫作用途径或者直接巯基化途径之一，而不是两种途径，但是一些微生物，如谷氨酸棒杆菌使用两种途径用于甲硫氨酸合成。"甲硫氨酸生物合成酶"包括通常在微生物中发现的促进曱硫氨酸产生的所有酶。表1列出了甲硫氨酸生物合成途径中的多种酶和编码它们的对应的基因，并且图l描绘了曱硫氨酸生物合成途径的图示。可以理解在一些孩吏生物中，编码对应酶的基因的名称可以与本文所列的名称不同。^丄'产碗肩凝_^參^4途径尹^雜#竊竭它//7#差西酶基因天冬氨酸激酶osA:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸乙酰转移酶附c汰高丝氨酸琥珀酰转移酶胱硫醚Y-合成酶膨诏胱硫醚p-裂合酶附CCo-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶0-琥珀酰高丝氨酸硫化氩解酶附CZ维生素B『依赖性甲硫氨酸合酶维生素B『独立的曱硫氨酸合酶附c必N"、亚甲基-四氢叶酸还原酶附"F^-腺苷曱硫氨酸合酶附C根据图1，甲硫氨酸从草酰乙酸(OAA)的合成通过中间物天冬氨酸磷酸天冬氨酸和天冬氨酸半醛进行。天冬氨酸半醛被高丝氨酸脱氢酶(b/W基因的产物，在其他生物中也称作/7^4,附d，AW爭)转变成高丝氨酸。土、、'在转硫作用途径中，高丝氨酸被高丝氨酸乙酰转移酶(柳WAT基因的产物，有时也称作附e")通过加入乙酰CoA转变成O-乙酰高丝氨酸，或者被基因的产物(高丝氨酸琥珀酰转移酶)通过加入琥珀酰CoA转变成O-琥珀酰高丝氨酸。通过胱硫醚v-合酶(附e诏基因的产物)，来自半胱氨酸的硫基团供给O-乙酰高丝氨酸或者O-琥珀酰高丝氨酸产生了胱硫醚。然后胱硫醚被w^C基因(在一些生物中也称作^cD基因)的产物胱硫醚p誦裂合酶转变成高半胱氨酸。在直接巯基化途径中，w"y基因(有时称作w^Z基因)的产物O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶催化硫醚直接加入O-乙酰高丝氨酸而形成高半胱氨酸。通过附WZ基因基因的产物O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶将一-硫醚基向O-琥珀酰高丝氨酸的直接加入，也可以在直接的巯基化途径中形成高半胱氨酸。不管使用转石克作用途径还是直接巯基化途径的那种途径，通过维生素812-依赖的曱硫氨酸合酶(/Me很基因的产物)或者B『独立的曱硫氨酸合酶(/w"五基因的产物)，通过加入甲基从高半胱氨酸随后产生甲硫氨酸。甲硫氨酸的甲基由甲基-四氬叶酸(甲基-THF)供给，曱基-四氬叶酸又通过m^F基因产物催化的反应中还原亚甲基-THF产生。一方面，本发明描述了产生曱硫氨酸的方法，其包括在甲基封端的硫醚，例如硫和/或曱基来源，优选二甲基二硫醚(DMDS)存在下培养产生曱硫氨酸的微生物，从而产生L-曱硫氨酸或者L-甲硫氨酸的盐。"产生甲硫氨酸的微生物"是能够产生曱硫氨酸的任何微生物，例如，细菌、酵母、真菌、古细菌等等。在一个实施方案中，产生甲硫氨酸的微生物属于棒杆菌属。在另一实施方案中，产生曱硫氨酸的微生物是谷氨酸棒杆菌。在再一个实施方案中，产生甲硫氨酸的微生物选自革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌或者相关的肠细菌)、革兰氏阳性细菌(例如，枯草芽孢杆菌(i5""7/附^^说/s)或者相关的芽孢杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母(5Vicc/^nw^cesce"v/w'fle)或者相关的酵母菌抹)，和古细菌，例如，适于用于本发明方法中的孩吏生物。在一个实施方案中，属于肠细菌组的所述^L生物是大肠杆菌。在另一实施方案中，属于芽孢杆菌属的微生物是枯草芽孢杆菌。在再一个实施方案中，酵母孩吏生物是酿酒酵母或者其近亲。在本发明的一个以上的实施方案中，在包含甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，优选二曱基二硫醚(DMDS)的培养基中培养本发明的微生物。在一个实施方案中，甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，例如DMDS以0.02%或更高浓度存在于培养基中。在另一实施方案中，曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，例如DMDS以0.04%或更高浓度存在于培养基中。在再一个实施方案中，甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源，例如DMDS以0.06%或更高浓度存在于培养基中。在本发明的一个以上的实施方案中，曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基来源是二甲基三硫、二曱基四硫或者硫醚的更高分子量的聚合物，其末端被曱基封端。被甲基封端的此类硫醚聚合物的实例是H3C-(SVCH3，其中n为2-50。在一个实施方案中，n为40-50。在另一实施方案中，n为30-40。在另一实施方案中，n为20-30。在另一实施方案中，n为10-20。在另一实施方案中，n为5-10。在优选的实施方案中，n为5、6、7、8、9或10。在另一优选的实施方案中，n为2、3或4。含有硫醚的聚合物的其他实例是聚(环氧乙烷硫醚)，其由内部环氧乙烷寡聚物和二硫键(见例如，LeeWfl/.,丑/owflCfY附o/ec"/^.2005Jan-Feb;6(l):24画6)和聚(^^克醚)组成。在一个实施方案中，使用緩释甲基封端的硫醚递送系统，例如，緩释硫和/或甲基递送系统，例如，緩释二甲基二硫醚(DMDS)递送系统向培养物递送曱基封端的石危醚，例如，硫和/或曱基来源。如本文使用的，短语"緩释曱基封端的硫醚递送系统"、"緩释硫和/或曱基递送系统"和"緩释二甲基二硫醚(DMDS)递送系统"包括任何惰性物质，其可以加入或者接触培养基使得小的疏7K有机化合物，如曱基封端的硫醚，如硫和/或曱基来源，如DMDS可以释放到7jC相，使得曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS的稳态浓度保持在所用的生物的亚致死浓度。"緩释甲基封端的硫醚递送系统"，例如，"緩释硫和/或甲基递送系统"，例如，"緩释二甲基二硫醚(DMDS)递送系统，，也允许这些化合物随时间以对微生物无毒并且不会不利地影响^:生物自身生长的水平延长、持续释放这些化合物到溶液中。在一个实施方案中，曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS的緩释递送系统是液体，其与水不溶混，但是可以溶解甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS。在优选实施方案中，甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS的緩释递送系统是珠状大孔聚苯乙烯树脂，例如，AmberliteTMXAD4。AmberliteTMXAD4由不溶性小珠组成，其作为浸渗氯化钠和碳酸钠的水湿产品提供。在甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS的吸收前，如生产商推荐的用乙醇和水洗涤AmberliteTMXAD4，在水中产生悬浮液。甲基封端的硫醚，如硫和/或曱基来源，如DMDS吸收到AmberliteTMXAD4并将该混合物加入培养基后，曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS以足够维持/w^F或/w^^营养缺陷型生长的速率从小珠释放。在一个实施方案中，曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS以0.1%或更高存在于含有AmberliteXAD4的培养基中。在另一实施方案中，甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS以0.2。/。或更高存在于含有AmberliteTMXAD4的培养基中。在再一个实施方案中，甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS以0.3。/。或更高存在于含有AmberliteXAD4的培养基中。在另一优选的实施方案中，緩释曱基封端的疏醚递送系统，例如，緩释硫和/或甲基递送系统，例如，DMDS緩释递送系统是緩释曱基封端的硫醚进料，例如，硫和/或曱基来源进料，例如，DMDS进料。如本文所用的短语"緩释甲基封端的疏醚进料"、"緩释硫和/或甲基来源进料，，和"緩释DMDS进料"是緩释进料，其将曱基封端的硫醚，例如，硫和/或曱基来源，例如DMDS以足够量渐增或者连续递送到培养物，使得产生目的产物，如曱硫氨酸，但是避免对生产微生物有毒性的水平。在再一个优选的实施方案中，本发明的緩释递送系统是对甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS可渗透的膜，并且允许甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS通过该膜扩散或者流入到生长培养基中。膜的非限制性实例包括在有机溶剂(如DMDS)和水性培养基存在下可以保持结构和功能完整性的^f壬寸可膜。》匕类膜在Milliporez〉司目录(MilliporeCorporationCatalog)和才示题为"1994-1995MilliporeDirect，，的技术参考手册(MilliporeCorporation,Bedford,MA，USA)中描述，将其完整引入本文作为参考。合适的膜包括包含PVDF(聚偏氟乙烯)、PTFE(聚四氟乙烯)、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚砜、尼龙和聚碳酸酯的那些膜，其具有或者没有亲水涂层。此外，可以用作緩释二甲基二硫醚(DMDS)递送系统的物质的非限制性实例包括其他珠化的疏水树脂、动物油、矿物油、化学油、植物油、合成油、有机溶剂、氯碳化合物、氟碳化合物、氯氟碳化合物，或者其组合。如本文所述，其中已经遗传改变了甲硫氨酸生物合成途径，例如以过量产生O-乙酰基高丝氨酸的微生物导致在含有甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基来源，如DMDS的培养基中甲硫氨酸的产量提高。因此，本发明还提供了产生甲硫氨酸的方法，其包括在曱基封端的硫醚，如硫和/或曱基来源，优选二甲基二硫醚(DMDS)存在下，培养具有失调的甲硫氨酸生物合成途径的微生物，从而产生甲硫氨酸。本发明的方法描述了微生物，例如，重组微生物，其优选包括如本文所述的载体或基因(例如，野生型和/或突变基因)和/或以导致产生目的产物(如甲硫氨酸)的方式培养。术语"重组"微生物包括微生物(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)，其已经经遗传改变、修饰或工程化(例如，遗传工程化)，使得它与它所来源的天然存在的微生物相比显示出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核列时)。在另一优选实施方案中，设计或者工程化重组微生物，使得表达或过表达至少一种天然甲硫氨酸生物合成酶。术语"过表达的"包括在合适的生长培养基中表达基因产物(例如，生物合成酶)，其表达水平高于该微生物的操作前或者没有操作的相当的微生物中的表达水平。在一个实施方案中，可以遗传设计或者工程化微生物以*达一定水平的基因产物，该水平高于在没有工程化的相当的微生物中的表达水平。优选地，生物合成酶编码基因被包括在重组载体中和/或从重组载体表达生物合成酶。技术人员将理解表达或者过表达基因产物的微生物由于编码该基因产物的核酸序列和/或基因的表达或过表达而产生或者过量产生该基因产物。术语"经操作的微生物"包括这样的微生物，其已经被工程化(例如，遗传工程化)或者修饰，使得该微生物的甲硫氨酸生物合成途径的至少一种酶的量或者结构被修饰，使得曱硫氨酸产量增加。此类微生物的修饰或工程化可以根据本文描述的任一种方法，包括但不限于，生物合成途径的失调和/或至少一种生物合成酶的过表达。"经操作的"酶(例如，"经操作的"生物合成酶)包括这样的酶，其表达、产生或者活性已经被改变或者修饰，使得该酶的至少一种上游或下游前体、底物或产物与对应的野生型或者天然存在的酶相比被改变或者修饰(例如，前体、底物和/或产物的改变或修饰的水平、比率等等)。"经操作的，，酶还包括一种酶，其中对例如一种或多种产物或者中间体的抑制，如反馈抑制的抗性已经得到增强。例如，能够在例如甲硫氨酸存在下有效发挥酶促功能的酶。术语"过表达的"或"过表达"包括基因产物(例如，甲硫氨酸生物合成酶)的水平表达高于该微生物操作前或者在没有操作的相当的微生物中的表达水平。在一个实施方案中，可以遗传操作(例如，遗传工程化)微生物以过表达一定水平的基因产物，该水平高于该微生物操作前或者在没有操作的相当的微生物中的表达水平。遗传操作可以包括，但不限于，改变或者修饰与特定基因的表达有关的调节序列或位点(例如，通过加入强启动子、诱导型启动子或者多个启动子或者通过除去调节序列使得表达是组成型的)，^奮饰特定基因的染色体位置，改变与特定基因如核糖体结合部位或者转录终止子相邻的核酸序列，增加特定基因的拷贝数，修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如，调节蛋白质、抑制子、增强子、转录激活物等等)，或者本领域中常规的失调特定基因表达的任何其他常规方法(包括但不限于，使用反义核酸分子，例如，阻断阻抑蛋白的表达和/或^f吏用增变等位基因，例如，增强遗传变异和加速例如适应性进化的细菌等位基因)。在另一实施方案中，可以在物理上或者环境上操作微生物以过表达一定水平的基因产物，该水平高于微生物操作前或者在没有操作的相当的微生物中的表达水平。例如，可以在已知或者怀疑增强特定基因的转录和/或特定基因产物翻译的物质存在下处理或者培养孩史生物，使得转录和/或翻译得到增强或者增加。备选地，可以在经选择以增强特定基因的转录和/或特定基因产物翻译的温度下培养微生物，使得转录和/或翻译得到增强或者增力口。本发明优选的"重组"微生物是具有失调的曱硫氨酸生物合成途径或者酶的微生物。术语"失调的，，或者"失调"包括改变或者修饰微生物中编码生物合成途径中的酶的至少一种基因，使得孩t生物中该生物合成酶的水平或者活性被改变或者修饰。优选地，改变或者修饰编码生物合成途径中的酶的至少一种基因使得该基因产物得到增强或者增加。短语"失调的途径，，还可以包括这样的生物合成途径，其中一种以上的编码生物合成途径中的酶的基因被改变或者修饰，使得一种以上的生物合成酶的水平或活性被改变或者修饰。"失调"微生物中途径的能力(例如，同时失调给定生物合成途径中的一种以上的基因，例如，2、3、4、5、6、7种基因)由^:生物中的特定现象引起，其中在遗传物质的连续片段上相互相邻存在的基因编码的一种以上的酶(例如，2、3、4、5、6、7等种生物合成酶)被称作"操纵子"。术语"操纵子"包括至少两个相邻的基因或者ORF,任选在序列中在至少一个基因或ORF的5'或者3'端重叠。术语"操纵子，，包括协调的基因表达单位，其含有启动子和可能地与一种或多种、优选至少两种结构基因(例如，编码酶，如生物合成酶的基因)结合的调节元件。结构基因的表达可以例如通过结合调节元件的调节蛋白或者通过转录的反终止协同地调节。结构基因可以转录得到编码所有结构蛋白质的单个mRNA。由于操纵子中包括的基因的协同调节，单个启动子和/或调节元件的改变或者修饰可以导致操纵子编码的每种基因产物的改变或者修饰。调节元件的改变或者修饰可以包括但不限于，除去内源启动子和/或调节元件、加入强启动子、诱导型启动子或者多个启动子或者除去调节序列使得基因产物的表达被修饰、改变操纵子的染色体位置、改变与操纵子相邻或者操纵子内的核酸序列如核糖体结合位点、增加操纵子的拷贝数、修饰涉及操纵子转录和/或操纵子基因产物的翻译的蛋白质(例如，调节蛋白、抑制子、增强子、转录激活物等等)，或者本领域常规的失调基因表达的任何其他常规方法(包括但不限于，例如使用反义核酸分子阻断阻抑蛋白的表达)。失调还可以涉及改变一种或多种基因的编码区以产生例如，反馈抗性的或者抗产物或者中间物的抑制，或者具有更高或者更低比活性的酶。本发明的尤其优选的"重组"微生物已经被遗传工程化以过表达细菌来源的基因或者基因产物。术语"细菌来源的"或者"来自"例如细菌，包括在细菌中天然发现的基因，或者细菌基因编码的基因产物(例如，高丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶和O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶)(例如分别由附ca:、Ao附(也称作aw等)，和附^y编码)。在一个实施方案中，产生曱硫氨酸的微生物的至少一种甲硫氨酸生物合成酶^L失调。在优选实施方案中，失调的甲硫氨酸生物合成酶是O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。在另一实施方案中，产生曱硫氨酸的微生物的至少两种甲硫氨酸生物合成酶被失调。在一个优选的实施方案中，失调的甲硫氨酸生物合成酶是高丝氨酸乙酰转移酶和高丝氨酸脱氢酶。在另一优选实施方案中，失调的曱硫氨酸生物合成酶是O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和高丝氨酸乙酰转移酶。在一个实施方案中，本发明描述了甲硫氨酸生物合成途径的多种生物合成酶的修饰。具体地，本发明描述了通过修饰或者改变编码所述生物合成酶的基因<务饰与所述途径有关的多种酶活性。如本文所用的术语"基因"包括核酸分子(例如，DNA分子或者其区段)，其在生物中可以通过基因间DNA(即，间插或者间隔DNA,其天然处于该基因的侧翼和/或分离生物的染色体DNA中的基因)与另一基因或者其他基因分开。备选地，基因可以与另一基因稍微重叠(例如，第一个基因的3，末端与第二个基因的5'末端重叠)，重叠的基因通过基因间DNA与其他基因分离。基因可以直接合成酶或者其他蛋白质分子(例如，可以包含编码序列，例如，编码蛋白质的连续可读框(ORF))或者可以自身在生物中是有功能的。生物中的基因可以聚簇在操纵子中，如本文定义，所述操纵子通过基因间DNA与其他基因和/或操纵子分离。如本文所用的"分离的基因，，包括这样的基因，其基本上没有该基因所来自的生物的染色体DNA中天然位于该基因侧翼的序列(即，没有编码另一种或不同蛋白质的相邻编码序列、相邻的结构序列等等)，并且任选包括5，和3，调节序列，例如，启动子序列和/或终止子序列。在一个实施方案中，分离的基因主要包括蛋白质的编码序列(例如，编码棒杆菌蛋白质的序列)。在另一实施方案中，分离的基因包括蛋白质(例如，棒杆菌蛋白质)的编码序列和相邻的5，和/或3，调节序列，该调节序列来自该基因所来源的生物的染色体DNA(例如，相邻的5，和/或3，棒杆菌调节序列)。优选地，分离的基因含有小于约10kb、5kb、2kb、lkb、0.5kb、0.2kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp核脊紗歹寸，其天然位于该基因所来源的生物的染色体DNA中该基因的侧翼。如本文所用的"具有突变的基因"或"突变基因"包括具有包括至少一个改变(例如，替代、插入、缺失)的核苷酸序列的基因，所述改变使得所述蛋白质不同的活性。在一个实施方案中，例如，当在相似的条件下测定(例如，在相同温度下培养的微生物中测定)时，具有突变的基因或者突变基因编码与野生型基因编码的多肽或蛋白质相比具有增加活性的多肽或蛋白质。如本文所用的"增加的活性"或者"增加的酶活性"是这样的活性，其比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白质的活性大至少5%,优选比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白质的活性大至少5-10%，更优选大至少10-25%或甚至更优选至少25-50%、50-75%或75-100%。上面引用的值中间的范围，例如，75-85%、85-卯％、90-95%也意在被本发明包括。如本文使用的"增加的活性，，或者"增加的酶促活性"还包括比野生型基因编码的多肽或蛋白质的活性大至少1.25倍，优选比野生型基因编码的多肽或蛋白质的活性大至少1.5倍，更优选至少2倍、甚至更优选至少3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。在另一实施方案中，例如，当在相似的条件下测定(例如，在相同温度下培养的微生物中测定)时，具有突变的基因或者突变基因编码与野生型基因编码的多肽或蛋白质相比具有降低活性的多肽或蛋白质。突变基因还可以不编码蛋白质或者产量水平降低的野生型多肽。如本文所用的"降低的活性，，或者"降低的酶活性"是这样的活性，其比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白质的活性低至少5%，优选比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白质的活性低至少5-10%，更优选低至少10-25%和甚至更优选低至少25-50°/0、50-75%或75-100%。上面引用的值中间的范围，例如，75-85%、85-卯％、90-95%也意在被本发明包括。如本文所用的"降低的活性"或者"降低的酶活性，，还包括已经被缺失或"敲除"的活性(例如，比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白质的活性低约100%)。在一个以上的实施方案中，本发明的具有失调基因组合的微生物产生甲硫氨酸，其水平例如比每种失调的基因存在时产生的甲硫氨酸水平总和大至少1-2%,或大至少3-5%，或大至少5-10%，或大至少10-20%，或大至少20-30%,或大至少30-40%，或大至少40-50%，或大至少50-60%,或大至少60-70%，或大至少70-80%，或大至少80-卯％,或大至少卯-95%。在一些实施方案中，包括失调基因的组合的微生物产生的甲硫氨酸的水平比每种失调的基因存在时产生的甲硫氨酸水平总和高至少2倍、或至少2.5倍、或至少3倍、或至少3.5倍、或至少4倍、或至少4.5倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少15倍、或至少20倍、或至少25倍、或至少30倍、或至少35倍、或至少40倍、或至少45倍、或至少50倍、或至少100倍。在其他实施方案中，包括改变的基因组合的微生物在合适的发酵条件下产生的甲硫氨酸的量比存在每种改变的基因或者不存在基因改变时微生物产生的量的总和大至少5g、或至少7g、或至少8g、或至少9g、或至少10g、或至少llg、或至少12g、或至少13g、或至少14g、或至少15g、或至少16g、或至少17g、或至少18g、或至少19g、或至少20g、或至少25g、或至少30g、或至少40g、或至少50g/升。本文描述的微生物产生的甲硫氨酸的水平可以使用本文所述的一种或多种测定法容易地测量。可以根据任何普遍接受的用于测量具体的目的蛋白质的活性的测定法测量活性。例如，通过测量从细胞或微生物分离或者纯化的蛋白质的活性，可以直接测量或测定活性。备选地，可以测量或测定细胞或者微生物内或者细胞外培养基中的活性。例如，突变基因的测定(即，编码降低的酶活性的所述突变体)可以通过在微生物，如其中所述酶是稳定敏感的突变微生物中表达所述突变的基因，并测定该突变基因互补温度敏感型(Ts)突变体的酶活性的能力还完成。编码"增加的酶活性"的突变基因可以是比例如对应的野生型基因更有效地互补Ts突变体的基因。编码"降低的酶活性，，的突变基因是例如，没有对应的野生型基因那样有效互补Ts突变体的基因。技术人员将理解即使核酸或者基因序列中的单个替代(例如，编码对应的氨基酸序列中的氛基酸改变的碱基替代)与对应的野生型多肽或蛋白质相比也可以显著影响所编码的多肽或蛋白质的活性。如本文定义的突变基因(例如，编码突变多肽或蛋白质)可以与编码蛋白质同源物的核酸或者基因容易地区分，因为突变基因编码具有改变活性的蛋白质或多肽，任选在表达所述突变基因或者产生所述突变蛋白或多肽的微生物(即，突变微生物)中与对应的表达野生型基因的微生物相比可观察到为不同的或者可区分的表型。相比，蛋白质同源物可以具有相同或者基本上相似的活性，任选当在微生物中产生时，与表达野生型基因的对应微生物相比在表型上不可辨别。因此，例如，不是核酸分子、基因、蛋白质或多肽之间的序列同一性程度用于区分同源物和突变体，而是所编码的蛋白质或多肽的活性区分同源物和突变体同源物具有例如低序列同一性(例如，30-50%序列同一性)而具有基本上等同的功能活性，突变体例如共有99%序列同一性而具有显著不同或改变的功能活性。在一个实施方案中，本发明的重组微生物是革兰氏阳性生物(例如，由于存在围绕微生物的革兰氏阳性细胞壁，而保留碱性染料，如结晶紫的微生物)。在优选实施方案中，本发明的重组微生物是棒杆菌属微生物。在一个实施方案中，重组微生物为芽孢杆菌属。在另一优选实施方案中，重组微生物选自地衣芽孢杆菌(5tf"7/附//c/^附yb/7M/)、解淀粉芽孢杆菌(必《"7/附fl/w^/o/^Me/acie/w)、J5fl"7/附Aa/o^/尸a"s、枯草芽孑包杆菌(5"ci7/"51和短小芽孢杆菌(5""7/附p"柳7"s)。在另一实施方案中，重组微生物是革兰氏阴性(排阻碱性染料)生物。在另一实施方案中，本发明的重组微生物是属于肠细菌的微生物。在优选实施方案中，重组微生物是属于选自沙门菌属(1^/附卵《//")、埃希氏菌属(」Esc/^r/c/r/")、克雷伯氏菌属(氾^>//")、沙雷菌属0^irffftVi)和变形杆菌属(iVote"s)的属的微生物。在更优选的实施方案中，重组微生物是埃希氏菌属(^c^m'c/^1)。在甚至更优选的实施方案中，重组微生物是大肠杆菌(」Esc力c/c似flco//)。在另一实施方案中，重组孩t生物是酵母属(例如，酿酒酵母)酵母和古细菌(Archaea)。本发明的一个重要的方面涉及培养本发明的微生物，使得产生目的化合物(例如，甲硫氨酸)。术语"培养，，包括保持和/或生长本发明的活微生物(例如，保持和/或生长培养物或菌林)。在一个实施方案中，在液体培养基中培养本发明的微生物。在另一实施方案中，在固体培养基或半固体培养基中培养本发明的微生物。在优选实施方案中，在包含对于微生物的保持和/或生长必须或者有益的营养物(例如，碳源或者碳底物，例如，糖类、烃、油、脂肪、脂肪酸、有机酸和醇；氮源，例如，胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，如磷酸、其钠和钾盐；微量元素，例如镁、铁、锰、钙、铜、锌、硼、镍、钼和/或钴盐；以及生长因子，如氨基酸、维生素、生长促进剂等等)的培养基(如无菌液体培养基)中培养本发明的微生物。根据本发明产生的微生物可以连续或者分批发酵或者以补料分批或者重复补料分批方法培养以产生甲硫氨酸。已知的培养方法的综述可以见Chmid的教科书(A—,oze版c/r"汰7.￡7"yi7r/*""g/"&J5/ove^/ii/r/^fwfecAw/A:(GustavFischerVerlag，Stuttgart，1991))或者Storhas的教科书(5/omiA:tomiww//m》/^re￡f/7'c/^wigew(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994》。优选地，在受控的pH下培养本发明的微生物。术语"受控的pH，，包括导致产生目的产物(例如，甲硫氨酸)的任何pH。在一个实施方案中，在约7的pH下培养微生物。在另一实施方案中，在6.0到8.5的pH下培养孩史生物。可以通过本领域技术人员已知的任一种方法保持希望的pH。还优选地，在受控的通气下培养本发明的微生物。术语"受控的通气"包括足够的通气(例如，氧气)以导致产生目的产物(例如，甲石克氨酸)。在一个实施方案中，通过调节培养物中的氧气水平，例如，通过调节溶解在培养基中的氧气量来控制通气。优选地，通过搅拌培养物控制培养物的通气。通过螺旋桨或者类似的机械搅拌设备，通过旋转或者摇动培养容器(例如，管或瓶)或者通过多种泵动设备提供搅拌。还可以经由培养基(例如，经由发酵混合物)穿过无菌空气或氧气控制通气。还优选地，在没有过量泡沫(例如，通过加入消泡剂)存在下培养本发明的微生物。此外，本发明的微生物可以在受控的温度下培养。术语"受控的温度，，包括导致产生目的产物(例如，曱硫氨酸)的任何温度。在一个实施方案中，受控的温度包括15。C到95。C之间的温度。在另一实施方案中，受控的温度包括15。C到70。C之间的温度。优选的温度为20。C到55°C，更优选30。C到50°C.微生物可以在液体培养基中培养(例如，保持和/或生长)，并且优选连续或者间歇培养，通过常规方法如静置培养、试管培养、摇动培养(例如，旋转摇动培养、摇瓶培养等等)、通气旋动培养或者发酵进行培养。在优选实施方案中，在摇瓶中培养微生物。在更优选的实施方案中，在发酵罐(例如，发酵方法)中培养微生物。本发明的发酵方法包括，但不限于，分批、补料分批和连续方法或者发酵方法。短语"分批方法"或者"分批发酵"指这样的系统，其中培养基、营养物、补充添加剂等等在发酵开始设置并且在发酵期间不受到改变，然而，可以试图控制诸如pH和氧气浓度等因子以防止过量的培养基酸化和/或微生物死亡。短语"补料分批方法"或者"补料分批"发酵指分批发酵，只是随着发酵的进行，加入一种或多种底物或补充物(例如，以增量加入或者连续加入)。短语"连续方法"或"连续发酵"指这样的系统，其中将确定的发酵培养基连续加入到发酵罐并且将等量使用的或者"条件的，，培养基同时除去，优选用于回收目的产物(例如，甲硫氨酸)。已经开发了多种此类方法并且它们是本领域公知的。将使用的培养基必须以合适的方式满足具体菌株的需要。用于多种微生物的培养基的描述包含在美国细菌学协会的手册"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"(WashingtonD.C.，USA,1981)中。适于用于培养基的碳源为例如，糖和糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素、油和脂肪，如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油、脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸、醇，如甘油和乙醇，和有机酸，如乙酸。这些物质可以单独或者作为混合物使用。有机含氮化合物，如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素或者无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵可以用作氮源。氮源可以单独或者作为混合物使用。磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氩二钾或者对应的含钠盐可以用作磷源。除了DMDS夕卜，末端用甲基封端的二甲基三疏、二甲基四硫或者更高分子量硫醚聚合物、有机和无机的含硫化合物，如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐和硫/[戈硫酸盐可以用作额外的硫源。培养基可以还包含生长必须的金属盐，如硫酸镁或者硫酸铁。最后，除了上述物质外，还可以使用必需和非必需生长物质，如氨基酸和维生素。此外，可以向培养基中加入合适的前体。所提到的起始物质可以以单个批的形式加入，或者可以在培养期间以合适的方式进料。碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或者氨水，或者酸性化合物，如磷酸或硫酸可以以合适的方式用于控制pH。消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于控制泡沫的产生。可以将具有选择作用的合适物质，如抗生素加入培养基中保持质粒的稳定性。为了保持需氧条件，向培养物中导入氧气或者含有氧气的气体混合物，如空气。培养物的温度通常为20。C到45。C，优选25。C到40。C。持续培养直到已经形成了最大的目的产物。该目标通常在10小时到160小时内达到。短语"在产生目的产物的条件下培养"包括在适合或者足够得到目的化合物的产量或得到希望产量的具体待产生的化合物的条件(如温度、压力、pH、持续时间等等)下保持和/或生长微生物。例如，培养持续足够的时间以产生所希望量的化合物(例如，曱硫氨酸)。优选地，培养持续足够的时间以基本上达到该化合物的合适产量(例如，足够达到合适浓度的甲硫氨酸的时间)。在一个实施方案中，培养持续约12到24小时。在另一实施方案中，培养持续约24到36小时、36到48小时、48到72小时、72到96小时、96到120小时、120到144小时、或者大于144小时。在另一实施方案中，培养持续足够的时间以达到甲硫氨酸的希望的生产产量，例如，培养敞生物4吏得产生至少约7到10g/L、或至少10到15g/L,或至少约15到20g/L、或至少约20到25g/L、或至少约25到30g/L、或至少约30到35g/L、或至少约35到40g/L、或至少约40到50g/L甲硫氨酸。在其他实施方案中，在一定条件下培^^L生物使得在约24小时内、约36小时内、约48小时内、约72小时内、或约96小时内产生甲石克氨酸的优选产量，例如在上面给出范围内的产量。本发明的方法还可以包括回收目的化合物(例如，甲硫氨酸)的步骤。术语"回收"目的化合物包括从培养基浓缩、提取、收获、分离或纯化化合物。可以根据本领域已知的任何常规分离或者纯化方法进行化合物的回收，包括但不限于，用常规树脂(例如，阴离子或者阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等等)处理，用常规吸附剂(例如，活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、讽土等等)处理，改变pH，溶剂萃取(例如，用常规溶剂如醇、乙酸乙酯、己烷等等)，透析，过滤，浓缩，结晶，重结晶，pH调节，冻干，干燥，蒸发等等。例如，通过首先从培养物除去微生物，可以从培养基回收甲硫氨酸。优选地，"提取"、"分离"或者"纯化"本发明的目的化合物使得所得制备物基本上没有其他培养基组分(例如，没有培养基组分和/或发酵副产物)。短语"基本上无其他培养基组分"包括目的化合物的制备物，其中该化合物与产生该化合物的培养物的培养基组分或者发酵副产物分离。在一个实施方案中，制备物具有大于约80%(干重)的目的化合物(例如，小于约20%的其他培养基组分或者发酵副产物)，更优选大于约90%的目的化合物(例如，小于约10%其他培养基组分或者发酵副产物)，更优选大于约95%的目的化合物(例如，小于约5%其他培养基组分或者发酵副产物)，最优选大于约98-99%的目的化合物(例如，小于约1-2%的其他培养基组分或者发酵副产物)。^^开还包括生物转化方法，其描述了多种本文所述的重组微生物。术语"生物转化方法"在本文中也称作"生物转变方法"，包括导致产生(例如，转化或者转变)合适的底物和/或中间化合物成为目的产物(例如，曱硫氨酸)的生物学方法。用于生物转化反应中的^:生物和/或酶为允许它们执^f亍它们预期功能(例如，产生目的化合物)的形式。此类微生物可以是全细胞，或者可以仅仅是得到所希望的最终结果必要的那些细胞部分(例如，基因和/或酶)。可以将这些微生物悬浮(例如，在合适的溶液中，如緩冲溶液或者培养基中)、冲洗(例如，冲洗除去培养孩t生物的培养基)、丙酮干燥、固定化(例如，用聚丙烯酰胺凝胶或者k-角叉菜聚糖或者在合成的支持体如小珠、基质等等上)、固定、交联或者透化(例如，具有透化的膜和/或细胞壁使得化合物如底物、中间体或者产物可以容易地穿过所述膜或者细胞壁)。在备选实施方案中，例如当微生物是生物学无害(例如安全)时，不从微生物纯化目的化合物。例如，整个培养物(或者培养上清液)可以用作产物来源(例如，粗产物)。在一个实施方案中，培养物(或者培养上清液)不用修饰而直接使用。在另一实施方案中，将培养物(或者培养上清液)浓缩。在再一个实施方案中，将培养物(或者培养上清液)干燥或冻干。通过本发明得到的产物除了甲硫氨酸外还可以包括发酵培养液的其他组分，如磷酸盐、碳酸盐、剩余的糖类、生物量、复杂培养基组分，等等。//.:Tig裙凝为、f、本发明还描述了重组核酸分子(例如，重组DNA分子)，其包括本文描述的基因(例如，分离的基因)，优选棒杆菌基因，更优选谷氨酸棒杆菌基因，甚至更优选谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸生物合成基因。术语"重组核酸分子"包括已经改变、<务饰或者工程化的核酸分子(例如，DNA分子)，所述改变、修饰或者工程化使得它在核苷酸序列上与该重组核酸分子所来源(例如，通过加入、缺失或替代一个或多个核苷酸)的原来的或者天然核酸分子不同。优选地，重组核酸分子(例如，重组DNA分子)包括有效连接调节序列的本发明的分离的基因。短语"有效连接调节序列"指目的基因的核苷^列以允许该基因的表达(例如，增强的、增加的、组成型、基础的、减弱的、减少的或者抑制的表达)，优选该基因编码的基因产物的表达(例如，当重组核酸分子包括在如本文定义的重组载体中并且导入微生物中时)的方式连接到调节序列。如本文所用的术语"异源核酸"指不通常存在于目标生物中的核麟列。它们可以还包括存在于目标生物中，但是通常不在目的目标生物的遗传区中发现的核断列。类似地，术语"异源基因"指不存在于宿主生物的野生型分离林中的基因。异源核酸和异源基因通常包含重组核酸分子。异源核酸或者异源基因可以包含或不包含修饰(例如，通过加入、缺失或者替代一个或多个核苷酸)。;^^开还包括本文描述的多种基因和蛋白质的同源物。基因的"同源物"指核苷^f列，其与该基因的至少部分或者与它的互补链或者其部分基本上同一，条件是该核苷*列编码的蛋白质与该基因的同源物编码的蛋白质具有基本上相同的活性/功能。通过推定的同源物的氨基酸和核苷*列和所述基因(例如，谷氨酸棒杆菌基因"W、Ao附、附CX、附WF、we战、/mC好、we必、附WF、附WC和/we^T的核普酸序列或者它们的互补链)或它们编码蛋白质的序列之间的百分比同一性，可以鉴定本文所述基因的同源物。例如，通过视觉检查或者通过使用本领域已知的或者本文所述的多种计算机程序可以确定百分比同一性。例如，使用DevereuxWa/.(1984)7V"c/.^"Vfe.12:387戶斤述并且可以从UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWGCG))得到的GAP计算机程序，通过比较序列信息可以确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。使用如TatusovaCfl/.(1999)/^TW^Af/cw^o/.丄e".，174:247所述的基本局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST.RTM.))程序，通过比对两个核苷酸序列，也可以确定百分比同一性。例如，对于使用BLASTTM程序进行的核苷酸序列比对，默认设置如下匹配得分2，错配罚分-2,打开缺口和延伸缺口罚分分别为5和2，缺口时间减少(gap.times.dropoff)为50，期望值为10，字长ll，滤器(filter)为关闭(OFF)。如本文所用的术语"同源性"和"同源的"不限于指定具有理论上的共同遗传祖先的蛋白质，而是包括可以在遗传上无关但是仍然经进化而执行相似功能和/或具有相似结构的蛋白质。本文所述的多种蛋白质的功能同源性还包括具有其同源物的对应蛋白质活性的蛋白质。为了蛋白质具有功能同源性，不需要它们在它们的M酸序列中具有显著同一性，而是具有功能同源性的蛋白质通过具有相似的或者相同的活性，如酶促活性定义。类似地，具有结构同源性的蛋白质被定义为具有类似的三级(或者四级)结构并且不必需要氨基酸同源性或者编码它们的基因的核酸同源性。在一些情况中，结构同源性可以包括仅在蛋白质的活性位点或者结合位点保持结构同源性的蛋白质。除了结构和功能同源性外，本发明还包括与本文所述的多种蛋白质和酶具有至少部分氨基酸同一性的蛋白质。为了确定两个M酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的将序列比对(例如，可以在一个蛋白质的M酸序列中引入缺口以与另一蛋白质的氨基酸序列最佳比对)。然后比较对应的氨基酸位置上的氨基酸残基。当一个序列中的位置被另一序列中对应位置上相同氨基酸占据时，这两个分子在该位置上是同一的。两条序列之间百分比同一性是这些序列享有的同一位置数目的函数(即，％同一性=同一位置数/位置总数xl00)。在一些实施方案中，本文所述分子的核酸和M酸序列包含与本文所述的核酸或^J^酸序列杂交或者至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99。/o或以上同一性的核苷酸序列或者^i^^列。本发明还包括本领域中公知的用于本文所述的蛋白质的遗传工程化以产生具有改进的或者修饰特征的酶的技术。例如，本领域中可利用的教导中公知^參饰蛋白质，使得该蛋白质具有增加的或者减少的底物结合亲和性。还有利的并且在本领域的教导内的是设计具有增加或者减少的酶促速率的蛋白质。尤其对于多功能酶，有用的是差别地细孩史调节蛋白质的多种活性以在特定环境下最佳地执行。此外，调节酶对反馈抑制(例如，被甲硫氨酸)的敏感性的能力可以通过选择性改变参与甲硫氨酸或者可能参与负或者正反馈的其他辅因子的结合或者协调的氨基酸来完成。此外，遗传工程化包括与在转录和翻译水平上表达的调节有关的事件。例如，当完全或者部分操纵子用于克隆和表达时，可以修饰基因的调节序列，例如，启动子或者增强子序列，〗吏^^它们产生希望水平的转录。本文所述的任一种基因的"同源物"还可以通过该同源物编码的蛋白质的活性鉴定。例如，这种同源物可以互补它的同源物基因中的突变。如本文使用的术语"调节序列"包括影响(例如，调控或调节)其他核酸序列(即基因)表达的核酸序列。在一个实施方案中，调节序列被包括在重组核酸分子中，处于相对于具体目的基因相似或相同的位置和/或方向上，如为调节序列和目的基因观察到的出现在天然的，如在天然位置和/或方向上。例如，重组核酸分子中可以包括目的基因，其有效连接到调节序列，在天然生物中，该调节序列伴随或者邻接目的基因(例如，有效连接到"天然，，调节序列(例如，连接到"天然"启动子)。备选地，目的基因可以包括在重组核酸分子中，有效连接到在天然生物中伴随或邻接另一(例如，不同的)基因的调节序列。备选地，目的基因可以包括在重组核酸分子中，有效连接到来自另一生物的调节序列。例如，来自其他微生物的调节序列(例如，其他细菌调节序列、噬菌体调节序列等等)可以有效连接到具体目的基因。在一个实施方案中，调节序列是非天然或非天然存在的序列(例如，已经经修饰、突变、替代、衍生、缺失的序列，包括化学合成的序列)。优选的调节序列包括启动子、增强子、终止信号、抗终止信号和其他表达控制元件(例如，抑制子或者诱导子结合的序列和/或例如在转录的mRNA中，转录和/或翻译调节蛋白质的结合位点)。此类调节序列描述于例如Sambrook，J.,Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Afo/ecw/fWC7(w/"g:j丄fl6ora,or^Mflww"A2/w/，^/.,Co/t/SpnVig/Ttf/^or丄a6onitoi^，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989，和Patek，M."a/，(2003)/ow7m/o/祝otec^"o/ogy104:311-323中。调节序列包括指导核苷酸序列在微生物中组成型表达的那些(例如，组成型启动子和强组成型启动子)、指导核苷酸序列在微生物中诱导型表达的那些(例如，诱导型启动子，例如，木糖可诱导的启动子)和减弱或者阻抑核苷酸序列在微生物中表达的那些(例如，减弱信号或阻抑序列)。还在本发明范围内的是通过除去或者缺失调节序列，调节目的基因的表达。例如，可以除去涉及转录的负调节的序列使得目的基因的表达得到增强。在一个实施方案中，本发明的重组核酸分子可以包括编码至少一种细菌基因产物(例如，甲硫氨酸生物合成酶)的核酸序列或者基因，其有效连接启动子或者启动子序列。本发明的优选启动子包括棒杆菌启动子和/或噬菌体启动子(例如，感染棒杆菌的噬菌体)。在一个实施方案中，启动子是棒杆菌启动子，优选强的棒杆菌启动子(例如，与棒杆菌中生物化学管家基因结合的启动子)。在另一实施方案中，启动子是噬菌体启动子。例如，用于革兰氏阳性生物的额外优选的启动子包括但不限于，超氧化物歧化酶、g/Y￡X、延伸因子Tu、fl附y和SPOl启动子。例如，用于革兰氏阴性微生，寸旦不限于，cos、toc、,/77-teZ、/a"//7/7-/flc、/"c/g、T7、T5、T3、-、//r、廳、SP6、入-PR或X孔。在另一实施方案中，本发明的重组核酸分子包括一种或多种终止序列(例如，转录终止序列)。术语"终止序列"包括用于终止mRNA转录的调节序列。终止序列(或者串联转录终止子)还可以用于稳定mRNA例如以抵抗核酸酶(例如，通过向mRNA加入结构)。在再一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括允许检测含有所述序列的载体的序列(例如，可检测的和/或选择标记)，例如，编码抗生素抗性序列或者克服营养缺陷性突变的基因，例如，吵C、药物标记、荧光标记，和/或比色标记(例如，/"cZ/(5-半乳糖苷酶)。在再一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括人工核糖体结合位点(RBS)或者转录成人工RBS的序列。术语"人工核糖体结合位点(RBS)"包括mRNA分子(例如，DNA内编码的)内核糖体结合(例如，以启动翻译)的位点，其与天然RBS(例如，天然存在的基因中发现的RBS)相差至少一个核苷酸。优选的人工RBS包才舌约5画6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30或更多个核苷酸,其约1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-15或更多核苷酸与天然RBS(例如，目的基因的天然RBS)不同。本发明还描述了包括如本文所述的核酸分子(例如，基因或者包含所述基因的重组核酸分子)的载体(例如，重组载体)。术语"重组载体"包括已经经改变、修饰或者工程化的载体(例如，质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、勦粒或者其他纯化的核酸载体)，所述改变、修饰或者工程化使得该载体比该重组载体所来源的原有或者天然核酸分子含有更多、更少或者不同的核酸序列。优选地，重组载体包括生物合成酶编码基因或者包括所述基因的重组核酸分子，其有效连接到调节序列，例如，启动子序列、终止子序列和/或人工核糖体结合位点(RBS)，如本文所定义。在另一实施方案中，本发明的重组载体包括增强细菌中复制的序列(例如，复制-增强序列)。在一个实施方案中，复制增强序列在大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌中发挥功能。在另一实施方案中，复制增强序列来自pBR322。在再一个实施方案中，本发明的重组载体包括抗生素抗性序列。术语"抗生素抗性序列"包括促进或者赋予宿主生物(例如，棒杆菌)的抗生素抗性的序列。在一个实施方案中，抗生素抗性序列选自C"《氯霉素抗性)序列、fe"四环素抗性)序列、W附(红霉素抗性)序列、WM(新霉素抗性)序列、Afl/J(卡那霉素抗性)序列和S/7"(大观霉素抗性)序列。本发明的重组载体还可以包括同源重组序列(例如，设计用于允许目的基因重组到宿主生物的染色体的序列)。本领域技术人员将还明白载体的设计可以根据诸如待遗传工程化的微生物的选择、目的基因产物的表达水平等等定制。如本文所用的"坎贝尔进"(Campbellin)指最初宿主细胞的转化体，其中完整环状双链DNA分子(例如质粒)已经通过单次同源重组事件(杂交进(crossin)事件)整合到染色体中，并且有效导致所述环状DNA分子的线性化形式插入到染色体的第一个DNA序列中，该第一个DNA序列与所述环状DNA分子的第一个DNA序列同源。"被坎贝尔进"(Campbelledin)指已经整合到"坎贝尔进"转化体的染色体中的线性化DNA序列。"坎贝尔进"含有第一个同源DNA序列的副本，其每个拷贝包括并且围绕一个拷贝的同源重组交换点。该名称来自AlanCampbell教授，他首次提出了该类型的重组。如本文所用的"坎贝尔出"(Campbellout)指"坎贝尔进"转化体的后代细胞，其中在"坎贝尔进"DNA的线性化插入的DNA上所含的第二个DNA序列和与所述线性化插入片段的第二个DNA序列同源的染色体来源的第二个DNA序列之间发生了第二次同源重组事件(杂交出(crossout)事件)，该第二次重组事件导致缺失(投下)一部分整合的DNA序列，但是重要地，还导致一部分(这可以小至单个碱基)整合的被坎贝尔进的DNA保留在染色体中，从而与最初的宿主细胞相比，"坎贝尔出"细胞在染色体中含有一个或多个有意的改变(例如，单个碱基替换、多个碱基替换、插入异源基因或者DNA序列，插入额外一个或多个拷贝的同源基因或者经修饰的同源基因，或者插入包含一个以上的这些上述所列实例的DNA序列)。"坎贝尔出"细胞或者林系通常但不必须，通过对"被坎贝尔进"DNA序列，如枯草芽孢杆菌基因的一部分(希望抛弃该部分)的基因进行反选择得到，所述基因当在存在约5%到10%蔗糖下生长的细胞中表达时是致死的。使用或不使用反选择，通过使用任何可筛选的表型筛选所希望的细胞，可以得到或者鉴定希望的"坎贝尔出，，细胞，所述表型为诸如但不限于，菌落形态、菌落颜色、存在或不存在抗生素抗性、(通过聚合sm式反应)存在或不存在给定的DNA序列、存在或不存在营养缺陷型、存在或不存在酶、菌落核酸杂交、抗体筛选，等等。术语"坎贝尔进"和"坎贝尔出，，还可以在多种时态中用作动词来指上述方法。可以理解导致"坎贝尔进，，或"坎贝尔出，，的同源重组事件可以在同源DNA序列内的DNA碱基范围内发生，并且因为同源序列将对于该范围的至少部分是相互相同的，所以通常不可能精确地指出哪里发生了交换事件。换句话说，不可能精确地指出哪个序列最初来自插入的DNA，哪个最初来自染色体DNA。此外，第一个同源DNA序列和第二个同源DNA序列通常通过部分非同源区域分开，并且该非同源区域保持放置在"坎贝尔出，，细胞的染色体内。为了实用，在谷氨酸棒杆菌中，通常第一个和第二个同源DNA序列长为至少约200个威基对，并且可以长达几千个碱基对，然而，可以安排步骤使用更短或更长序列。例如，第一个和第二个同源序列的长度可以为约500到2000个碱基，并且通过将第一个和第二个同源序列安排为大约相同长度，优选相差少于200个碱基对，最优选两者较短的为较长者威基对长度的至少70%,可以方便从"坎贝尔进"得到"坎贝尔出"。通过下面的实施例进一步阐明本发明，不应将这些实施例理解为限制。将本申请全文引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容引入本文作为参考。实施例实施例1:M2014菌抹的产生将谷氨酸棒杆菌菌林ATCC13032用DNAA(也称作pH273)(SEQIDNO:l)转化并"被坎贝尔进"以产生"坎贝尔进"菌林。图2显示了质粒pH273的示意图。然后将"坎贝尔进，，菌林"坎贝尔出，，以产生"坎贝尔出，，菌林M440,其含有编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶(/^/i/^的基因。所得的高丝氨酸脱氢酶蛋白质包括氨基酸改变，其中S393改变为F393(称作〃s^S393F)。随后将菌林M440用DNAB(也称作pH373)(SEQIDNO:2)转化得到"坎贝尔进"菌林。图3描绘了质粒pH373的示意图。然后将"坎贝尔进"菌林"坎贝尔出，，以产生"坎贝尔出"菌林M603,其含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶(Js/^r)(/"C编码)的基因。在所得的天冬氨酸激酶蛋白质中，T311改变为1311(称作LysCT31U)。发现菌抹M603产生约17.4mM赖氨酸，而ATCC13032菌林不产生可测量量的赖氨酸。此外，M603菌林产生约0.5mM高丝氨酸，相比ATCC13032菌林不产生可测量的量，如表2中概述。^2:芽#J7rC7^m2;^Af6。3/^的葛纟扇^、0-乙脱差豸^^凝、f絲絲舰麟量菌林高丝氨酸(mM)O-乙醜基高丝氨酸(mM)甲硫氨酸(mM)赖氨酸(mM)ATCC130320.00.40.00.0M6030.50.70.017.4用DNAC(也称作pH304，其示意图在图4描绘)(SEQIDNO:3)转化菌林M603,得到"坎贝尔进"菌抹，其然后被"坎贝尔出"得到"坎贝尔出"菌林M690。M690菌抹含有metH基因(也称作P497附43:离游Af6W和M6卯,^^葛^威^、O-乙疯差葛^^^、f碗^凝和鹰减凌时量<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>随后如下诱变M6卯菌抹将生长在BHI培养基(BECTONDICKINSON)中的M603过夜培养物用50mM柠檬酸緩冲液pH5.5洗涤，在30。C用N-曱基-N-亚硝基胍(50mM柠檬酸緩沖液pH5.5中10mg/ml)处理20分钟。处理后，细胞用50mM柠檬酸緩冲液pH5.5再次洗涤并平板接种在含有下面成分的培养基中(所有提到的量都是对500ml培养基计算)10g(NH4)2S04;0.5gKH2P04;0.5gK2HP04;0.125gMgS04*7H20;21gMOPS;50mgCaCl2;15mg原儿茶酸；0.5mg生物素；1mg硫胺素；和5g/lD，L誦乙硫氨酸(SIGMACHEMICALS,CATALOG#E5139)，用KOH调节到pH7.0。此外，培养基含有0.5ml^:量金属溶液，其组成为10g/1FeS04*7H20;1g/1MnS04*H20;0.1g/1ZnS04*7H20;0.02g/1CuS04;和0.002g/1NiCl2*6H20，所有都溶解在0.1MHC1中。通过过滤对最终培养基除菌并向培养基中加入40ml无菌的50%葡萄糖溶液(40ml)和无菌琼脂至1.5%终浓度。将最终的含有琼脂的培养基倒入琼脂板中并标记为最小乙硫氨酸培养基。将诱变的菌林在平板(最小乙硫氨酸)上涂布并在30。C培育3-7天。分离生长在培养基上的克隆并在相同的最小乙硫氨酸培养基上再次划线培养。选择一些克隆用于甲硫氨酸生产分析。如下分析甲硫氨酸生产。菌林在CM琼脂培养基上30。C下生长两天，该培养基含有10g/1D-葡萄糖，2.5g/1NaCl;2g/1尿素；10g/1Bacto蛋白胨(DIFCO);5g/1酵母提取物(DIFCO);5g/1牛肉膏(DIFCO);22g/1琼脂(DIFCO);其在约121。C高压灭菌20分钟。菌林生长后，刮去细胞并重悬浮在0.15MNaCl中。对于主要培养物，将刮去细胞的悬浮液以600nm的起始OD与0.5g固体和高压灭菌的CaC03(RIEDELDEHAEN)—起加入1.5到10ml培养基II(见下文)中，并在没有挡板的100ml摇瓶中在有轨摇动平台上以约200转/分钟(rpm)30。C下培养细胞。培养基II含有40g/l蔗糖；60g/l来自糖蜜的总糖(根据糖含量计算)；10g/1(NH4)2S04;0.4g/IMgS04*7H20;0.6g/1KH2P04;0.3mg/1硫胺素女HC1;1mg/1生物素；2mg/lFeS04;和2mg/1MnS04。将培养基用NH4OH调节到pH7.8并在约120°C高压灭菌约20分钟。高压灭菌并冷却后，加入来自过滤除菌贮存液(200pg/ml)的维生素B12(氰钴胺素)(SIGMACHEMICALS)至100照/1的终浓度。从培养基取样品并测定氨基酸含量。使用Agilent氨基酸方法在Agilent1100系列LC系统HPLC(SeriesLCSystemHPLC)上测定产生的氩基酸，包括甲硫氨酸。用邻苯二醛对样品的前置柱衍生允许在HypersilAA-柱(AGILENT)上分离后定量所产生的氨基酸。分离甲硫氨酸滴定度为M690中至少两倍的克隆。用于其他实验中的一种此类克隆命名为M1179并且在2005年5月18日保藏在DSMZ菌林保藏中心，菌抹保藏号为DSM17322。将该菌林的氨基酸产量与菌林M6卯的相比较，如下面的表4概述。表4:菌株M690和M1197产生的高丝氨酸、0-乙酰基高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>将菌株M1179用DNAF(也称作pH399，其示意图在图5描绘)(SEQIDNO:4)转化产生"坎贝尔进"菌林，其随后被"坎贝尔出"得到菌抹M1494。该菌林在高丝氨酸激酶的基因中含有突变，其导致所得的高丝氨酸激酶中氨基酸从T190改变为Al卯(称作HskTl卯A)。将菌林M1494产生的>#^酸产量与菌林M1197的产量比较，如下面的表5概述。45..霧辨It/"/97和M"W/^^吝鱼凌虔、0-乙脱差吝^扇^、f^;减^和橫我虔^量<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>将菌林M1494用DNAD(也称作pH484，其示意图在图6描绘)(SEQIDNO:5)转化产生"坎贝尔进"菌林，其随后被"坎贝尔出"得到M1990菌林。M1990菌林过表达附WY等位基因，使用groES-启动子和EFTU(延伸因子Tu)-启动子(称作P497P1284w"r)(P497Pi284的序列在SEQIDNO:6中显示)。将菌林M1494的氩基酸产量与菌林M1990的产量相比，如下面表6中概述。霧祷A/7^^和Af"卯/^^吝^^^、0-乙疯差葛^處^、f^r肩鑀^^虞减^W量<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>(mM)M149418.30.22.550.1M199018.20.35.648.9将菌林M1990用DNAE(也称作pH491，其示意图在图7描绘)(SEQIDNO:7)转化产生"坎贝尔进"菌林，其随后被"坎贝尔出"得到"坎贝尔出"菌抹M2014。M2014菌林过表达/we"等位基因，使用超氧化物歧化酶启动子(称作P3U9we")。将菌林M2014的氨基酸产量与菌林M2014的产量相比，如下面表7中概述。^7:萝祷M/^^和ikf/9",i^葛^我^、0-乙疯差豸^^^、f碗我^和^^^^量菌林高丝氨酸(mM)O-乙耽基高丝氨酸(mM)甲硫氨酸(mM)赖氨酸(mM)M19卯18.20.35.648.9M201412.31.25.749.2实施例2.谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸营养缺陷型向曱硫氨酸中掺入二曱基二硫醚为了确定谷氨酸棒杆菌是否能够向曱硫氨酸中掺入DMDS，构建了M2014中的附"F缺失(实施例1中描述)。将M2014用质粒pOM86(图9)(SEQIDNO:8)转化产生"坎贝尔进"菌林。然后将"坎贝尔进"菌林"坎贝尔出"得到称作OM63的"坎贝尔出"菌林。为了确定该甲硫氨酸营养缺陷型OM63是否可以利用DMDS合成甲硫氨酸，通过测量600nm的OD，测定OM63和亲本M2014的试管培养物的生长。培养物生长在无甲硫氨酸的培养基(配方见下文)、补充甲硫氨酸的无甲硫氨酸培养基或者补充不同量的DMDS(Aldrich目录号32，041-2)的无甲硫氨酸培养基中。设计该实验用于确定DMDS是否可以穿过细菌的细胞膜，在细胞质内就被还原成甲硫醇，并且随后被MetY或MetB或者另一种酶如MetC用作底物与O-乙酰基-高丝氨酸一起直接形成L-甲硫氨酸。还设计该实验以测定DMDS对细胞生长的毒性(如果存在)。如表8中所示，谷氨酸棒杆菌附WF营养缺陷型可以利用DMDS作为生长的底物，并因此用于甲硫氨酸生产。此外，在含有补充0.02%、0.04%或0.06%DMDS的5ml无曱硫氨酸培养基的试管中，所有菌林的光密度都是相似的。含有补充0.08%或0.1%DMDS的5ml无甲硫氨酸培养基的试管具有很少的生长或者没有生长，可能是由于DMDS在这些浓度下的毒性。最后，如所预期的，没有DMDS的无曱硫氨酸培养基维持M2014的生长，但不维持OM63的生长。表8.在补充或者没有补充甲硫氨酸或者二甲基二硫醚(DMDS)的无甲硫氨酸培养基中30。C生长36小时的谷氨酸棒杆菌士官培养物在600nm下的光密度<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>试管培养物在金属盖周围用石蜡膜密封。无曱疏氨酸的培养基补充40mg/1甲石克氨酸的无Met培养基。该实验的结果表明DMDS可以被吸收并且被谷氨酸棒杆菌还原裂解成曱硫醇并且进入甲硫氨酸途径以维持曱硫氨酸营养缺陷型的生长。备选地，DMDS是O-乙酰基-高丝氨酸硫化氬解酶或者O-O-琥珀酰-高丝氨酸疏化氢解酶或者另一种酶的直接底物。换句话说，可能一种酶催化DMDS的还原裂解和掺入到甲硫氨酸中。无甲硫氨酸的培养基-l升100mlDifcoTM甲硫氨酸测定培养基(MethionineAssayMedium)(105g/l)100ml10xSpizizen盐*6ml葡萄糖(50%)4ml"4B，，溶液"100mg苏氨酸40mg半胱氨酸785mldH205ml2%CaCl2**4B溶液硫胺素(BO-0.25mg/ml氰钴胺素(812)-50ng/ml生物素-50mMKPO4pH=7.0中28ng/ml盐酸吡喷醇-1.25mg/ml10xSpizizen盐*20g/1硫酸铵I74g/1磷酸氢二钾(三水合物)60g/1砩酸二氢钾(无7JC)10g/1柠檬酸钠2g/1硫酸镁(七水合物)高压灭菌后，加入3.5ml0.4%FeCl3*6H20和lml微量营养素溶液1M效量营养素溶液-l升0.15gNa2Mo04'2H202.5gH3B030.7gCuS04*5H201.6gMnCl2'4H200.3gZnS04'7H20通过包含约15到20g/L琼脂，可以制备该培养基的固体形式。这可以通过标准步骤完成，如向约750ml水中加入20g琼脂，高压灭菌，并且在仍然熔化时，以无菌贮存液加入上面列出的成分。实施例3.开发DMDS向谷氨酸棒杆菌的递送系统以掺入到甲硫氨酸中如上面讨论的，DMDS如果以高于约0.06%的量直接加入到液体培养物中，那么是有毒的。为了克服该问题，寻找将允许DMDS随时间向溶液中緩慢释放的递送系统。AmberliteXAD4是珠化的大孔聚苯乙烯树脂，下文中称作"XAD4"，将其选择作为递送系统，是因为它是惰性的，能够吸附小的疏水有机化合物，能够被水湿润，并且具有高的表面积和小的孔径。进行试管实验以便确定可以被XAD4吸附并且仍然允许生长的DMDS的最大量。为此，使用5ml培养基对OM63和M2014进行试管实验。每个试管含有100jil的XAD4的50。/。混悬液(v/v)和无甲硫氨酸的培养基、补充甲硫氨酸的无甲硫氨酸的培养基或者补充不同量的DMDS的无曱硫氨酸的培养基。通过向用爭〉开的配合金属盖盖住的无菌20mMx20mMx150mM试管中加入5ml无甲硫氨酸的培养基，准备试管测定。向每个试管中加入100pl的XAD4在水(50%v/v)中的无菌混悬液。对试管接种在含有BHI培养基(BactoTM脑心浸液(BrainHeartInfusion)(Becton，DickinsonandCompany,Sparks,MD))的试管中过夜生长的细胞，然后旋转并用无曱硫氨酸的培养基冲洗两次。将细胞以50%起始体积重悬浮在无甲硫氨酸的培养基中。细胞混悬液(5pl)用作每个试管的接种物。细胞接种后，向每个试管以所示的浓度(v/v)加入DMDS。将试管在平台摇床上以200rpm(转/分钟)在30。C下培养24-48小时。使用GenesysTM2分光光度计，通过600nm下的光密度测量细胞生长。如表9中所示，在含有补充0.1%、0.2%、0.3%或0.4%DMDS的无甲硫氨酸的培养基的试管中，所有菌株的光密度都相当类似。补充0.5%DMDS的试管对OM63生长显示出负作用，然而，该水平的DMDS似乎被M2014耐受。总之，将DMDS吸附到XAD4小珠上允许更多的DMDS被加到谷氨酸棒杆菌的液体试管培养物中。足够的DMDS从小珠释放，允许甲硫氨酸营养缺陷型的完全生长。表9在有或者没有所示量的DMDS的无甲硫氨酸的培养基1中在XAD42存在下于30C生长42小时的OM63和M2014在600nm的交密度<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>1无甲硫氨酸的培养基2每个试管含有5ml培养基加上100^AmberliteXAD4的50%混悬液。孔隙率=0.5mlAnl。接种试管后加入DMDS。接种物-细胞在含有BHI的试管中过夜生长，然后旋转并用无Met的培养基冲洗两次。将细胞以50%的起始体积重悬浮。将该细胞混悬液(5叫用作每个试管的接种物。此外，仅仅XAD4对于细胞生长没有明显的不利效果。如所预期的，含有无DMDS的无甲硫氨酸培养基的试管支持M2014的生长，但是不支持OM63的生长。含有补充40mg/1曱疏氨酸但是没有DMDS的无曱硫氨酸培养基的试管对于M2014导致类似的最终光密度，但是比对OM63所预期的光密度要低。这可能是由于XAD4吸附一些补充的曱硫氨酸，从而限制OM63细胞生长。实施例4.气态DMDS可以支持曱硫氨酸合成和OM101(J附e访,z/w^F)的生长以前已经表明DMDS的类似物二甲基二硒醚(DMDSe)在气态对微生物是有毒的，但是可以用于选择缺少O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的突变体(Brzywczy，J.，和Paszewski，A.(1994)9:1335-1342和Treichler,H.J"""/.(1978)在FEMSSymposiumNo.5，pp177-199,R.HutterWeds，AcademicPress,NewYork)。^!寻DMDSe作为液滴导入培#^盖的底面得到约5fiM的终浓度(如果DMDSe的完全供给扩散到琼脂并溶解在其中)。然而，没有提到化合物DMDS，并且通过气态扩散是否可以提供足够水平的DMDS用于生长(与类似物抑制相反)不是显而易见的。为了比较，在上面实施例1-3的液体生长实验中，DMDS的浓度为约10mM(例如对于0.1%的情况)或者比上述参考文献中DMDSe高约2000倍。然而，气态DMDS的递送可以防止用液体DMDS看到的毒性。为了测试该可能性，将约108个细胞的OM101(z/;^诏，J附CF)的菌苔冲洗至相对无甲硫氨酸，并接种在含有约25ml琼脂培养基的无曱硫氨酸的琼脂板上。DMDS通过在平板中心点样50fil或者通过在平板中心的琼脂中切一个孔并在孔中放置50piDMDS进行递送。如果DMDS扩散到平板各处，那么终浓度将为约25mM。对照平板接受细胞菌苔，但是无DMDS。将平板一起放置在比这堆平板稍大的密封的聚丙烯塑料盒中，并在30。C培养48-60小时。用DMDS在菌苔上直接点样的平板具有从液体DMDS点样处约30mm的杀灭区，但是平板的剩余部分均匀覆盖生长菌苔。含有置于孔中的液体DMDS的平板没有杀灭区，而是均匀覆盖在整个平板的生长菌苔，包括平板周围和直到中心孔。通常，当将需要的营养物置于营养物的营养缺陷菌苔中央时，见到生长梯度，在营养物最近处发生最快速生长。最后，没有加入DMDS但是与接受DMDS的平板置于相同的密封塑料盒的对照平板得到OM101生长的完整菌苔。这些观察提示谷氨酸棒杆菌营养缺陷型的生长可以通过气态DMDS的扩散维持。为了证明气态转移，进行了一个实验，其中从以前涂布OM101菌苔的无甲石克氨酸的平板的琼脂中心切出环形(25x25x5mm)孔。在这些孔中放置无菌红色聚丙烯螺旋帽((20x20x5mm)，其来自Sarstedt(No.62.554.002))圆锥形管，其用作50jil液体DMDS的杯子。该方法确保:液体DMDS不与细胞直接接触并且仅仅通过气态扩散到达细胞，因为DMDS不通过聚丙烯快速扩散。将平板在30。C下包在气密塑料盒中培育。用于该实验的对照平板是涂布OM101菌荅的无曱硫氨酸的平板并且在单独密闭的塑料盒中不存在DMDS下于3(TC培育。2天后，观察到完全的细菌菌苔覆盖具有含有液体DMDS的无菌盖的平板，并且在单独容器中缺少DMDS的对照平板没有显示生长。这些实验一^明液体DMDS的直接接触对于对OMIOI的毒性是必需的，并且相比，气态DMDS是无毒的并且仍然可以被OM101用于生长，并且因此用于甲硫氨酸合成。从而，在发酵罐中，可以将DMDS以气态递送到细胞中以便克服DMDS在液态下对细胞的毒性。这可以通过蒸发或者沸腾DMDS并将DMDS蒸汽泵入发酵容器中，或者通过经由液体DMDS在它的途径上鼓空气或氧气泡到发酵容器来完成。实施例5.AmetEAmetH菌林的构建构建缺失附C五和we/好的谷氨酸棒杆菌菌株。将M2014用质粒pH469(图IO)(SEQIDNO:9)转化得到"坎贝尔进"菌林。然后将"坎贝尔进"菌林"坎贝尔出，，得到"坎贝尔出"菌林OM228C-2，其含有we必缺失。然后将OM228C-2用质粒pH300(图11)(SEQIDNO:10)转化得到"坎贝尔进，，菌林。然后将该"坎贝尔进"菌林"坎贝尔出，，得到"坎贝尔出"菌林OM246C,该菌林含有A附W五和A附W好。如所预期的，双缺失菌抹的两种分离菌OM246C-l和OM246C-2是曱硫氨酸营养缺陷型并且在试管培养中在糖蜜培养基中不产生甲硫氨酸。实施例6.MetY负责催化甲硫醇与O-乙酰基-高丝氨酸之间的反应以产生甲硫氨酸的主要酶促活性因为文献报导提出MetB(Flavin,M.和S.Slaughter1967.祝oc/h附.132:400-405;Kanzaki,H.etal.1987./.必/oc/^柳.163:105-112;Kiene，R.P.etal.1999.j/p/.五wv/fvm.MicrM"/.65:4549-4558)或MetZ(Yamagata，S.1971./Bi》c^附.(Tokyo)70:1035)可以参与曱硫醇掺入，所以用含有A附C5等位基因的OM63衍生物进行实验以鉴定涉及谷氨酸棒杆菌中甲硫醇掺入的酶。如上面阐明的，谷氨酸棒杆菌可以通过甲疏醇将二曱基二硫醚(DMDS)直接掺入到曱硫氨酸中。在实施例3中，确定DMDS如果以小于约0.06%的量直接加入到液体培养基中，那么可以被细胞耐受，然而，如果在递送系统如吸附剂AmberliteTMXAD4存在下加入，那么加入液体培养物的DMDS的量可以在观察到毒性之前增力口5倍。用甲硫氨酸营养缺陷型OM63(A附WF)进行"概念证明"实验，表明谷氨酸棒杆菌可以利用DMDS维持A/MWF甲硫氨酸营养缺陷型的生长。为了进一步鉴定哪些酶涉及谷氨酸棒杆菌中甲硫醇向甲硫氨酸的掺入，对在we战中含有缺失的菌株测试它们在DMDS存在下生长的能力。在含有100jalAmberliteXAD4的50%混悬液和无曱硫氨酸的培养基或者补充不同量的DMDS的无甲硫氨酸培养基的试管中培养OM101C(A/w"F，A附e/J8)、实施例4中描述的OM246c(A附"F，A附"巧、OM63(Aw"F)，和M2014,OM101C(A附"F，A附e迅)来自用H216转化的OM63,H216含有与pSH315(HwangBJ，"dJ丑""e"》/.2002Mar;lM(5):l"7-86)相同的附e必缺失等位基因以缺失附e访。如表10所示，在含有补充0.1或者0.2%DMDS的无甲硫氨酸培养基的试管中，所有菌林的光密度都是相似的。除了OM101C之夕卜，所有菌林都能够在补充0.4%MDS的无曱硫氨酸培养基中生长，OM101C在0.3%DMDS下显示出生长抑制。仅仅菌林OM246C能够在0.5%DMDS存在下生长。这些结果一起表明，MetB、MetH/MetE和MetF对于曱硫醇向甲硫氨酸的掺入不是必需的。因此，MetY对于允许DMDS向甲硫氨酸的掺入的酶促活性AA够的。4J汰^长4试l5^弄^"摩^"量的Diktt)51^^/w&r/ZteX42M2存在T射尤f碗扇^培祟差'OAf63、OM7WC、OM2"C和M20"在6卯w附菌株亲本基因型DMDSDMDSDMDSDMDSDMDSDMDSmet0%.0.1%.0.2%.0.3%0.4%0.5%，_mg/1OM63M2014Jm^F0.03.03.91,50.12.40.03.33.42.11.60.13.0OM101OM63zTw^F0.02.53.11.60.050.021.9CzT/we访0.02.73.90.80.030.012.1OM246M2014Jme必0.04.34.23.33.63.13.9_Jwg^T0.04.53.83.63.22,44.3M2014黃本4.34.44.03.81.30,074.44.]4.34.23.52.30.034.7i无甲硫氨酸的培养基。2每个试管含有5ml培养基加上100nlXAD4的50°/。混悬液。加入XAD4和DMDS之后接种试管。接种物-细胞在含有BHI的试管中过夜生长，然后旋转并用无Met的培养基冲洗两次。将细胞以50%起始体积重悬浮。5pl细胞悬浮液用作每个试管的接种物。实施例7.鉴定MetY为具有O-乙酰基高丝氨酸甲硫醇硫化氢解酶活性的酶这里我们直接表明MetY而不是MetB是O-乙酰基高丝氨酸甲硫醇硫化氩解酶活性必需和足够的酶。用含有w"F、/we访和/wC缺失的不同组合的M2014衍生物进行试管实验。菌林在具有AmberliteTMXAD4小珠和有或者没有200mg/1DMDS或者100mg/1甲硫氨酸的无甲疏氨酸培养基中生长。接种物为每个试管约5xl()S个细胞。细胞在平台摇床上30。C下生长60小时，在OD6(M)下测量细胞密度。如表11所示，DMDS可以维持甲硫氨酸营养缺陷型OM63(A附WF)和OM101(A附CF,Awe访)的生长，然而，DMDS不维持含有附^y缺失的任何曱硫氨酸营养缺陷型如OM158或OM174的生长。通过用质粒pH215(SEQIDNO:ll)转化OM63得到"坎贝尔进，，菌抹构建OM158。SEQIDNO:ll中显示的核断列是pH215中缺失的附^y基因的区域，从附"y的起始密码子——残基1-3延伸到的终止密码子——残基912-914。该缺失周围的两个碱基是残基609-610。然后将该"坎贝尔进"菌林"坎贝尔出"得到"坎贝尔出"菌抹OM158,其含有A附WF，A附"F。通过用质粒pH215转化OM101得到"坎贝尔进"菌抹，构建OM174。然后将"坎贝尔进，，菌林"坎贝尔出"得到"坎贝尔出，，菌抹OM174,其含有A附WF，A附W5，A附^y。图8显示了使用质粒pH215缺失柳CF的部分之前(8A)和之后(8B)，在/weJ区域中谷氨酸棒杆菌染色体的结构。该数据表明MetY是负责O-乙酰基高丝氨酸甲硫醇硫化氢解酶活性的唯一酶，并且MetB或MetC都不含有足够水平的该酶促活性以在这些条件下生长。表ll.有或者没有0.2%DMDS和AmberliteXAD4下在试管中无曱硫氨酸的培养基中30"C生长60小时的菌株的OD6。o<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>实施例8.谷氨酸棒杆菌的营养缺陷型菌林中甲硫氨酸生产的效率一旦确定A附WF或A附e必AwW/f谷氨酸棒杆菌营养缺陷型可以利用DMDS合成甲硫氨酸，重要的是测定曱硫氨酸生产效率。进行摇瓶实验，其中比较OM246C和M2014。每个摇瓶含有20ml糖蜜培养基和800pl的AmberliteTMXAD4的50%混悬液，有或没有0.4%DMDS。如表12中所示，没有DMDS的OM246C几乎没有积累甲硫氨酸。相反，具有DMDS的OM246C积累约0，3g/l曱硫氨酸。从而，曱硫氨酸的产生从O-乙酰基-高丝氨酸直接向甲硫氨酸的转变发生，绕过了高半胱氨酸。最重要的是，在DMDS存在下生长的OM246C的甲硫氨酸滴定度的净增加断然确定当存在DMDS时，可以通过在曱硫氨酸合成的最后步骤中有缺陷的谷氨酸棒杆菌突变体产生甲硫氨酸。对照菌林M2014在DMDS存在或不存在下积累相似的氨基酸镨。有趣的是，在M2014中，DMDS稍稍刺激甲硫氨酸产量从约0.5g/1到约0.7g/l。这可通过DMDS的掺入与从常规的甲硫氨酸生物合成途径产生曱硫氨酸组合的累加效应解释。^".l-戈者发^"汰^^D3/i)^^4潜,培祟J^^^长的M20^/和O-Ac-菌林DMDSGly+HsehseMetlieLysOD'60020140pi0.00.0,.2L.65.40.50.02.6334.40.40.02.93480pi0.10.01.41.03.60.70.02.5304.30.60.02.538OM246C0pi5.33.00.70.70.30.00.11.8321.10.00.21.73080fil0.01.74.60.40.03.232_0.21.3_4.30.20.03.435i糖蜜培养基补充l。/o酵母提取物、生物素、BpB12、B6和100mg/1苏氨酸。2每个摇瓶含有20ml培养基加上800filXAD4的50%混悬液。加入XAD4和80nlDMDS(有或没有)后接种摇瓶。加入的DMDS的终浓度为0.4%v/v。接种物-细胞在含有BHI的试管中过夜生长，然后旋转并用无Met的培养基冲洗两次。将细胞以50%的起始体积重悬浮。将100nl细胞悬浮液用作每个摇瓶的接种物。3氨基酸以g/1报告。实施例9.DMDS向谷氨酸棒杆菌递送以掺入到曱硫氨酸的递送系统的进一步研发为了进一步研究DMDS的潜在递送系统(除了AmberliteTMXAD4之外)，研究了重白矿油(Sigma目录号400-5)和植物油、油菜油。因为油是疏水的，所以它们将能够溶解DMDS和潜在允许DMDS緩释到水性培养基中。向含有5ml有或者没有100mg/1甲硫氨酸的无甲硫氨酸培养基的试管中加入含有不同量的溶解DMDS的油(0.5ml)。在平台摇床中30。C培养24小时后，测量含有O、0.2、0.4、0.8和1,2。/。终浓度DMDS的培养基的光密度。如表13中所示，在含有高达0.4。/oDMDS的试管中发生OM246C的生长，而在含有溶解于矿物油中高达0.8%DMDS的试管中发生M2014的生长。然而，光密度与含有无矿物油的无甲硫氨酸培养基的试管培养物的光密度相比小于一半。与允许细胞生长的AmberliteTMXAD4相比，矿物油中DMDS的最大量对于M2014稍高(0.8°/。对0.4%),但是对于OM63是相似的(0.4%对0.4%)。当测试油菜油作为递送系统时，观察到相似的结果；然而，仅仅油菜油对于细胞生长的消极作用没有矿物油大(表14)。在这些油存在下生长的减弱可能部分是由于在试管培养中缺少足够的通气、细胞膜的破坏或者这两者的组合。然而，显然油可以用作发酵中DMDS的递送系统。来自动物、矿物、化学或者植物来源的油或者其组合可以用于DMDS向细胞的递送。其他可能的递送系统包括合成油、有机溶剂、氯碳化合物、氟碳化合物，或者氯氟碳化合物。额外的方法将是受控的DMDS进料，其向细胞提供低于毒性水平的稳态水平。选择DMDS抗性的谷氨酸棒杆菌菌林将还减轻DMDS毒性组织。最后，利用内在更抗DMDS毒性的宿主种类将也减轻该问题。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>实施例10.菌抹改良大肠杆菌附e必基因已经被突变或者进化成利用甲硫醇(wo2004/076659A2)。使用甲硫氨酸营养缺陷型，例如，缺少MetE和MetH或MetF的甲硫氨酸营养缺陷型，但是在选择培养基中使用DMDS而不是甲硫醇，可以进行类似的选择步骤。从而，可以通过用甲硫氨酸营养缺陷型开始，并且在缺少甲硫氨酸但是含有DMDS的基本培养基上选择生长或者更快的生长，并且使用或者不使用化学品、诱变、放射或者增变等位基因，选择具有将DMDS掺入甲硫氨酸能力更大的微生物，所述甲硫氨酸营养缺陷型例如可以产生O-乙酰基高丝氨酸或者O-琥珀酰高丝氨酸，但是不能利用高丝氨酸。该类型的选择可以集中在特定基因，如附e访基因、基因、/w"C基因或附"/基因(AugerWa/"2002Micn^/o/ogy148:507-518)，通过将所述基因插入质粒上并将该质粒导入缺少(通过缺失或者诱变)掺入DMDS的内在能力的菌林中，并进行如上述的选择来进行该所述类型的选择。此类经选择的微生物的后代，或者从此类经选择的微生物分离的基因也可以用于构建或者衍生甲硫氨酸生产菌林。实施例11.如果提供O-乙酰基高丝氨酸硫化氬解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，大肠杆菌可以将DMDS代谢成甲疏氨酸将大肠杆菌曱硫氨酸营养缺陷型CGSC3592(附CF6力和RY714B、MM294的/we必;:7V^(M柳"jy衍生物(也称作ATCC33625)和CGSC6315OwdL4/，^n，s"/7E"，AmMW7)用pH357(SEQIDNO:13;表达谷氨酸棒杆菌附C和附"X的质粒)，pH309(SEQIDNO:14;表达谷氨酸棒杆菌附"y的质粒)，或者pCLIK转化，pCLIK是与pH357和pH309有关的空载体，在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制(SEQIDNO:15)。在丰富培养基(LuriaBroth琼脂)上选择对25mg/L硫酸卡那霉素的抗性。将6种转化体平板接种在无甲疏氨酸的琼脂培养基上，在琼脂中心切出一个孔，向孔中加入50微升DMDS，并如实施例4中所述的在30。C温育平板。用pH309或pH357转化的两种菌林在该平板上生长，但是用空载体pCLIK转化的菌抹都不能生长，表明附e,y对于大肠杆菌利用DMDS合成曱硫氨酸是必需的和足够的。这些结果还支持如下观点MetY具有O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氬解酶活性，因为例如RY714B/pH309依赖于大肠杆菌MetA酶，已知其主要产生O-琥珀酰高丝氨酸。从而，大肠杆菌如果被如本文所述的工程化，那么能够输入DMDS，将其还原，并掺入到曱硫氨酸中。因为大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是不密切相关的生物，而都具有该能力，所以我们预期多种生物都具有该能力，并且可以将多种生物工程化以使用DMDS作为进料化合物之一产生甲硫氨酸。实施例12.反馈抗性O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的选择为了通过生物合成产生甲硫氨酸，希望使用反馈抗性O-乙酰基高丝氨酸石克化氢解酶和/或者o-琥珀酰高丝氨酸硫化氩解酶。在许多生物中，这些酶被曱硫氨^馈抑制。例如，谷氨酸棒杆菌中的MetY(O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶)被甲硫氨l馈抑制，甲硫氨酸对于甲硫氨酸合成M生产的。已经描述了推测抗甲疏氨酸抑制的突变形式的MetY(WO2004/108894A2)，但是这些形式可能不是提高甲硫氨酸生物合成的最好的形式。从而，仍然需要MetY的合适的反馈抗性形式。因为在本文已经表明MetY是可以赋予在DMDS上生长的酶，所以开发了如下用于选择有用的w^F等位基因的新方案。将缺少MetF或MetE和MetH并且任选还缺少MetY、MetB和/或MetC,但是经工程化以相对高O-乙酰基高丝氨酸合成的谷氨酸棒杆菌菌林(例如，OM174(JwWF，J附^fi，J柳"F)或OM246C(J附e必，zf附e^0)(美国临时专利申请号60/700,699，2005年7月18日申请，标题"MethionineProducingRecombinantMicroorganism，，)用表达MetY的质举立如pH357或pH309转化。通过质粒pH357或pH309产生的MetY,所得的菌林可以在含有DMDS的无甲硫氨酸培养基上生长。用甲硫氨酸类似物，如a-甲基曱硫氨酸、硒基蛋氨酸、正亮氨酸、四氟甲硫氨酸、甲硫氨酸异羟肝酸酯(Methioninehydroxamate)、乙硫氨酸、S國甲基半胱氨酸等等筛选抑制该菌林生长的甲硫氨酸类似物。在一些情况中，抑制该菌抹生长的类似物通过MetY的假反馈抑制进行抑制。换句话说，该类似物将结合MetY上的甲疏氨酸结合位点，并且抑制所述酶的活性。选择抗所述类似物的突变体(用或不用诱变)将导致MetY的变体，其抗所述类似物的结合和甲硫氨酸。从此类突变体候选物分离质粒DNA并再转化到幼稚的未突变的宿主菌林中，并且确定该类似物抗性表型是否由所引入的质粒编码。通过该篩选的质粒将含有一种或多种突变，它们的一些将赋予所希望的对甲硫氨酸的反馈抗性。上述产生和鉴定反馈抗性O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶变体的方案还适于分离反馈抗性O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶变体。该方法是类似的，但M始生物产生O-琥珀酰高丝氨酸而不是O-乙酰基高丝氨酸作为中间体，并且该质粒编码O-琥珀酰高丝氨酸石危化氬解酶而不是O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。换句话说，该质粒含有附WZ基因而不是附e"基因。上述对反馈抗性MetY或MetZ的选择也可以在不同于谷氨酸棒杆菌的生物中进行。例如，如上面的实施例11中所示，大肠杆菌RY714B/pH309或大肠杆菌CGSC3592/pH357等也可以在具有DMDS的无甲硫氨酸的培养基上生长，从而此类菌林也可以用于通过在含有DMDS的无曱硫氨酸的培养基上生长并选择对甲硫氨酸类似物的抗性，选择所希望的MetY变体。因为大肠杆菌MetA对于甲硫氨酸和一些类似物如a-曱基甲硫氨酸的抑制也是敏感的(UsudaY，KurahashiO"五wW腦.2005June;71(6):3228-34)，所以通过使用大肠杆菌附e"-突变林，并例如用pH357提供反馈抗性MetA或MetX,或者使用已经选择对该类似物产生抗性的附^4等位基因，可以增强所希望的附"r等位基因的选择。一般地，该方法将可以用于多种细菌、酵母、真菌、古细菌和植物。等同方案本领域技术人员将认识到或者仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意在被下面的权利要求包括。权利要求1.产生甲硫氨酸的方法，其包括在甲基封端的硫醚化合物存在下培养产生甲硫氨酸的微生物，从而产生甲硫氨酸。2.权利要求l的方法，其中所述甲基封端的硫醚化合物选自二甲基二硫醚(DMDS)、二甲基三硫、二曱基四硫和硫醚的更高分子量的聚合物，其末端被曱基封端。3.产生甲硫氨酸的方法，其包括在二甲基二硫醚(DMDS)存在下培养产生甲硫氨酸的微生物，从而产生甲硫氨酸。4.权利要求1-3任一项的方法，其中DMDS以0.02%或者更高浓度存在于培养物中。5.权利要求1-3任一项的方法，其中DMDS以0.06%或者更高浓度存在于培养物中。6.产生甲硫氨酸的方法，其包括在緩释二甲基二硫醚(DMDS)递送系统存在下培养产生曱硫氨酸的微生物，从而产生曱硫氨酸。7.权利要求6的方法，其中所述緩释DMDS递送系统是AmberliteTMXAD4.8.权利要求7的方法，其中所述緩释DMDS递送系统在培养物中以0.1%或者更高水平释放DMDS。9.权利要求7的方法，其中所述緩释DMDS递送系统在培养物中以0.3%或者更高水平释放DMDS。10.权利要求6的方法，其中所述緩释DMDS递送系统包含与水不溶混但是溶解DMDS的液体。11.权利要求10的方法，其中所述緩释DMDS递送系统包含选自动物油、矿物油、化学油、植物油、合成油、有机溶剂、氯碳化合物、氟碳化合物、氯氟碳化合物或者其组合的液体。12.权利要求6的方法，其中所述緩释DMDS递送系统是緩慢受控的DMDS进料。13.权利要求6的方法，其中所述緩释DMDS递送系统是DMDS通过DMDS可渗透的膜流动或者扩散。14.权利要求6的方法，其中所述緩释DMDS递送系统包含以气态输送DMDS。15.权利要求14的方法，其中通过蒸发或者沸腾液体DMDS产生气态DMDS.16.权利要求14的方法，其中通过经由液体DMDS鼓空气或者氧气泡产生气态DMDS。17.权利要求l、2、3或6的方法，其中所述产生甲硫氨酸的微生物属于棒杆菌属。18.权利要求l、2、3或6的方法，其中产生甲硫氨酸的微生物是谷氨酸棒杆菌。19.权利要求l、2、3或6的方法，其中产生甲硫氨酸的微生物选自革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母和古细菌。20.权利要求l、2、3或6的方法，其中产生甲硫氨酸的微生物的至少一种曱硫氨酸生物合成酶被失调。21.权利要求20的方法，其中所述微生物具有被失调的O-乙酰基高丝氨酸石危化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氩解酶。22.权利要求l、2、3或6的方法，其中产生甲硫氨酸的微生物的至少两种甲石充氨酸生物合成酶被失调。23.权利要求22的方法，其中所述微生物具有被失调的高丝氨酸乙酰转移酶或高丝氨酸琥珀酰转移酶和被失调的高丝氨酸脱氢酶。24.权利要求22的方法，其中所述微生物具有被失调的O-乙酰基高丝氨酸石危化氢解酶和被失调的高丝氨酸乙酰转移酶或者被失调的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和被失调的高丝氨酸琥珀酰转移酶。25.产生甲石危氨酸的方法，其包括在二甲基二硫醚(DMDS)的存在下培养具有失调的甲硫氨酸生物合成途径的微生物，从而产生甲硫氨酸。26.权利要求25的方法，其中所述微生物属于棒杆菌属。27.权利要求25的方法，其中所述孩t生物是谷氨酸棒杆菌。28.权利要求25的方法，其中所述孩t生物属于埃希氏菌属。29.权利要求25的方法，其中所述微生物选自革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母和古细菌。30.权利要求25的方法，其中所述微生物具有被失调的O-乙酰基高丝氨酸石危化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶。31.权利要求25的方法，其中所述微生物具有被失调的高丝氨酸乙酰转移酶或高丝氨酸琥珀酰转移酶和被失调的高丝氨酸脱氢酶。32.权利要求25的方法，其中所述微生物具有被失调的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和被失调的高丝氨酸乙酰转移酶或者被失调的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和被失调的高丝氨酸琥珀酰转移酶。33.权利要求25的方法，其还包括分离甲硫氨酸的步骤。34.包含根据权利要求33的分离的甲疏氨酸的组合物。35.根据上面权利要求任一项的方法合成的含有曱硫氨酸的产品。36.用于在二甲基二硫醚(DMDS)存在下产生甲硫氨酸的重组微生物，所述微生物具有失调的甲硫氨酸生物合成途径。37.权利要求36的微生物，其属于棒杆菌属。38.权利要求37的微生物，其是谷氨酸棒杆菌。39.权利要求36的微生物，其属于埃希氏菌属。40.提高DMDS的利用以进行甲疏氨酸生产的方法，其包括在缺少甲硫氨酸但是含有DMDS的基本培养基上选择生长或者较快生长的甲疏氨酸营养缺陷型。41.权利要求40的选择方法得到的微生物或者所述微生物的后代。42.从自权利要求40的选择方法得到的微生物得到的分离的基因。43.鉴定编码抗甲硫氨^馈抑制的O-乙酰基高丝氨酸疏化氢解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的突变等位基因的方法，其包括a)将依赖于DMDS的生物和质粒编码的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶以在无甲硫氨酸的培养基上生长的生物与抑制所述生物生长的曱硫氨酸类似物接触，b)选择所述生物的抗所述类似物的突变变体，c)分离所述突变变体，其中所述抗性表型由所述质粒编码，和d)测定所述质粒的相关部分的DNA序列以鉴定在所述O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的编码区中具有被改变序列的突变质粒，从而鉴定编码抗甲硫氨^馈抑制的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸石克化氢解酶的突变等位基因。44.权利要求44的方法，其中所述生物缺少甲硫氨酸合酶(MetE和MetH)或者亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)，并且所述无甲硫氨酸的培养基含有二甲基二硫醚(DMDS)。45.权利要求43或44的方法，其中所述生物是谷氨酸棒杆菌菌林。46.权利要求43或44的方法，其中所述生物是大肠杆菌菌抹。47.通过权利要求43的方法分离的突变的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶。48.含有通过权利要求43的方法分离的突变的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的生物。全文摘要本发明描述了用于产生甲硫氨酸的改进方法和生物。本发明阐明ΔmetF生物或者ΔmetEΔmetH生物，例如谷氨酸棒杆菌或者大肠杆菌的突变体可以使用甲基封端的硫醚来源，如二甲基二硫醚(DMDS)作为硫和甲基的来源以合成甲硫氨酸，避免了对MetH/MetE和MetF活性的需要和还原硫酸盐的需要。本发明还描述了涉及MetY(也称作MetZ)作为将甲基封端的硫醚来源如DMDS掺入到甲硫氨酸的酶的数据。谷氨酸棒杆菌的ΔmetFΔmetB菌株可以使用甲基封端的硫醚来源如DMDS作为硫醚和甲基的来源。此外，通过加入甲基封端的硫醚来源如DMDS，提高了过量产生O-乙酰基高丝氨酸的工程化原养型生物的甲硫氨酸产量。文档编号C12P13/12GK101223280SQ200680026206公开日2008年7月16日申请日期2006年7月18日优先权日2005年7月18日发明者A·赫罗尔德,C·克洛普罗格,H·施罗德,M·K·威廉姆斯,O·策尔德尔,R·R·约库姆,S·哈夫纳申请人:巴斯福股份公司