具有生物屏障的基于药代动力学的培养系统的制作方法

专利名称：具有生物屏障的基于药代动力学的培养系统的制作方法
技术领域：
本申请的公开内容涉及细胞培养技术，更具体地，涉及为了药代动力学研究而在微型(microscale)水平上促进流体系统之间的相互作用的系统和方法。
相关技术描述 药代动力学是药物和其他生物活性化合物从被导入体内时开始到消除时止的命运的研究。例如，口服药物的事件的顺序可以包括通过各种粘膜表面的吸收、通过血流向各种组织的分布、在肝脏和其他组织中的生物转化、在靶部位的作用、以及药物或代谢物在尿或胆汁中的消除。药代动力学提供了研究生物系统中化合物代谢的合理手段。关于药代动力学方程和模型的综述，参见，例如，Poulin和Theil(2000)J Pharm Sci.89(1)16-35；Slob等人.(1997)Crit RevToxicol.27(3)261-72；Haddad等人.(1996)Toxicol Lett.85(2)113-26；Hoang(1995)Toxicol Lett.79(1-3)99-106；Knaak等人.(1995)Toxicol Lett.79(1-3)87-98；Ball和Schwartz(1994)Comput Biol Med.24(4)269-76。
研究人员在药物、环境、营养、消费品安全性和毒理学研究中所面临的一个基本挑战是代谢数据和风险评估从体外细胞培养试验向动物的外推。尽管利用适当的药代动力学原理可以得出一些结论，但是仍然有相当的限制。所担心的一个问题是目前的筛选试验是在不复制其在天然环境中的功能的条件下使用细胞。循环流动、与其他组织的相互作用、和与生理应答相关的其他参数在标准组织培养形式中没有发现。例如，在大型细胞培养模拟(CCA)系统中，细胞在腔室底部生长。这些系统具有非生理学的高液体∶细胞比，并且具有不现实的细胞型之比(例如肝细胞与肺细胞之比)。在大型CCA系统的一种变形中，细胞在微载体珠上生长。这些系统更加类似于生理条件，但是仍然具有缺陷，因为对于预测性研究而言，它们没有足够准确地模拟生理条件。因此，得到的试验数据不是基于将在动物中发现的药物或毒素暴露的模式。
在活生物体内，浓度、时间和代谢相互作用，影响药理学或毒性反应的强度和持续时间。例如，体内肝功能的存在强烈影响药物代谢和生物利用度。肝脏清除活性药物是通过生物转化和排泄发生的。生物转化反应包括由细胞色素P450酶催化的反应，该酶转化许多在化学上不同的药物。第二生物转化阶段可以增加亲水基团，例如谷胱甘肽、葡糖醛酸或硫酸盐，以提高水溶性和加速通过肾脏排除出。
尽管生物转化可能是有益的，但是它也可能具有不希望的后果。化合物和生物体之间的复杂相互作用产生毒性。在生物转化过程中，产生的代谢物可能比亲代化合物毒性更强。许多用于毒性筛选的单细胞试验避开了这些复杂的细胞间和组织间效应。
结果，人类对于潜在药物的应答难以准确地预测，通常是不可靠的，并且常常是昂贵的。传统的预测人类应答的方法使用替代物—一般是静态的、同质的体外细胞培养试验或体内动物研究。体外细胞培养试验的价值有限，因为它们不能准确地模拟候选药物在人体内经历的复杂环境，因此不能准确预测人类的危险。类似地，尽管体内动物试验可以说明从基于细胞的体外试验中观察不到的这些复杂的细胞间和组织间效应，但是体内动物研究非常昂贵、劳动密集、耗时、并且当与人类危险相关时结果通常具有值得怀疑的相关性。
授予Shuler等人的美国专利No.5,612,188描述了一种多区室细胞培养系统。该培养系统使用诸如培养腔室、传感器和泵的大型部件，需要使用大量的培养基、细胞和受试化合物。该系统的运转非常昂贵，并且需要大量的操作空间。由于该系统是这样大规模的，因此生理学参数与在体内情况下所发现的参数相比有相当大的不同。在这种大规模下不可能准确地产生生理学现实的条件。
开发可以更好、更快、更有效地预测体内毒性和临床药物表现的微型筛选试验和装置在许多领域具有重要意义，也是本发明中所要解决的。这种微型装置可以准确地产生生理学现实的参数，并且更接近地模拟所测试的期望的体内系统。
发明概述 提供了用于微型细胞培养模拟(CCA)装置的装置、体外细胞培养和方法。本发明的装置允许将细胞在体外保持在其药代动力学参数值类似于在体内所发现的值的条件下。目标药代动力学参数包括细胞之间的相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、器官的相对大小、细胞的代谢、剪应力等。通过提供模拟细胞天然状态的基于药代动力学的培养系统，筛选和毒性试验的预测值和体内相关性得到提高。
微型培养装置包括通道的流体网络，这些通道隔离为不连续的但是相互连接的腔室。特定腔室的几何形状设计为提供与体内相应细胞、组织或器官所发现的参数相关的细胞相互作用、液体流动和液体停留参数。该流体学设计为准确地代表循环或淋巴系统的主要成分。在一个实施方案中，这些部件集成为芯片形式。这些几何形状的设计和确认以基于生理学的药代动力学(PBPK)模型为基础；这是一种将身体表示为相互连接的代表不同组织的区室的数学模型。
该装置的每个培养腔室中可以接种合适的细胞。例如，设计为提供肝脏药代动力学参数的腔室接种肝细胞，并且可以与接种在设计为提供脂肪组织药代动力学的腔室中的脂肪细胞流体连通。这产生了一种基于药代动力学的细胞培养系统，该系统准确地代表，例如，它所模拟的动物的组织大小比、组织∶血液体积比、药物停留时间。
在一个实施方案中，该系统包括第一微型培养装置和控制设备。第一微型培养装置具有许多微型腔室，该腔室的几何形状模拟多种与培养基的体内相互作用，其中每个腔室包括用于培养基流动的入口和出口，微流通道将这些腔室互相连接。控制设备连接到第一微型培养装置上，包括用于从第一微型培养装置获得数据并控制其药代动力学参数的计算机。
在另一个实施方案中，计算机包括微处理器、通用存储器、非易失性存储元件、包括与具有一个或多个传感器的微型培养装置之间的界面的输入/输出界面、和计算机软件。该计算机软件可在微处理器上执行，以分析来自传感器的数据，确定该微型培养装置的许多腔室中的生理学事件，调节该微型培养装置的腔室中培养基的流体流速，检测该微型培养装置的腔室中的生物学或毒理学反应，并且在检测后改变微型培养装置的一个或多种药代动力学参数。
如本文使用的单数形式“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文中明确说明不是这样。例如，“一种化合物”是指一种或多种这样的化合物，而“该细胞”包括一种特定细胞以及本领域技术人员所知的其他家族成员及其等同物。
本申请公开内容的一个实施方案涉及一种装置，该装置包括至少一个部件，该部件的尺寸设置为在如下条件下保持生物材料在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值。该装置进一步包括通透性材料。
在一个实施方案中，所述部件是微型部件。在一个实施方案中，通透性材料选自膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一个。
在一个实施方案中，通透性材料进一步包括位于微孔表面之中、之上或附近的有机或无机材料。
在一个实施方案中，通透性材料构造为模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中通过或穿过，或者物质在生物屏障中、通过生物屏障或被生物屏障吸收。在一个实施方案中，生物屏障选自下面的至少一种胃肠屏障、血脑屏障、肺屏障、胎盘屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅觉屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空气-组织屏障、血液-胆汁屏障、口屏障、肛门直肠屏障、阴道屏障和尿道屏障。
在一个实施方案中，所述至少一个药代动力学参数选自以下至少一个组织大小、组织大小比、组织∶血液体积比、药物停留时间、细胞间相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、细胞的代谢、剪应力、流速、几何形状、循环通过时间、液体分布、组织和/或器官之间的相互作用、和细胞的分子转运。
在一个实施方案中，该装置决定了物质在通透性材料中、通过通透性材料或被通透性材料的吸收、代谢或分布。在一个实施方案中，所述部件构造为代表下列至少一个中枢神经、循环、消化、胆道、肺、泌尿、眼、嗅觉、表皮和淋巴系统的至少一部分。在一个实施方案中，通透性材料位于所述装置的内部或外部。
在一个实施方案中，所述装置进一步包括至少一个与通透性材料连接的微流通道。
在一个实施方案中，流体在通透性材料中、通过通透性材料或靠近通透性材料的流动提供了至少一个药代动力学参数。在一个实施方案中，流体通过该装置流动的特性基于一种数学模型。在一个实施方案中，该数学模型是一种基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
在一个实施方案中，所述部件或通透性材料集成为芯片格式。
在一个实施方案中，通透性材料包括在微孔材料上培养的胃肠肠细胞层。在一个实施方案中，胃肠肠细胞层的至少一部分位于所述装置中，使得流体可以沿该层的任一侧流动，但是不穿过该层。在一个实施方案中，位于胃肠肠细胞层第一侧面上的至少第一微型部件代表胃肠道，位于该单层第二侧面上的至少第二微型部件代表循环系统。在一个实施方案中，所述装置进一步包括构造为含有相同或不同类型的生物材料的第三微型部件。
在一个实施方案中，通透性材料包括至少部分包覆有机材料的微孔材料。
在一个实施方案中，所述设备进一步包括位于通透性材料之中、之上或靠近其两侧的细胞。在一个实施方案中，该装置提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。在一个实施方案中，通透性材料任一侧上的细胞为相同的类型或不同的类型。
在一个实施方案中，所述设备进一步在通透性材料微孔表面之中、之上或附近包括肝细胞。在一个实施方案中，该微孔表面的至少一部分包括使肝细胞极化的蛋白质。
在一个实施方案中，通透性材料包括能够形成汇合单层的细胞系。
在一个实施方案中，所述设备进一步包括使肝细胞与通透性材料结合的粘合剂。在一个实施方案中，该粘合剂使肝细胞极化。在一个实施方案中，该粘合剂包括选自以下物质的至少一种蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
在一个实施方案中，所述设备进一步在通透性材料之中、之上或附近包括第二种类型的生物材料。
在一个实施方案中，所述设备进一步在通透性材料之中、之上或附近包括成纤维细胞。在一个实施方案中，所述设备进一步包括靠近通透性材料的第一侧面的血液替代物流动。在一个实施方案中，所述设备进一步包括靠近通透性材料的第二侧面的胆汁替代物流动。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，该方法包括在如下条件下保持生物材料在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值。该方法进一步包括使物质通过通透性材料的至少一部分。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将生物材料保持在微型部件之内或附近。
在一个实施方案中，通透性材料选自膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一种。
在一个实施方案中，通透性材料进一步包括在微孔表面之中、之上或附近的有机或无机材料。
在一个实施方案中，通透性材料构造为模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中通过或穿过，或者物质在生物屏障中、通过生物屏障或被生物屏障吸收。在一个实施方案中，生物屏障选自下面的至少一种胃肠屏障、血脑屏障、血液-胆汁屏障、肺屏障、胎盘屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅觉屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空气-组织屏障、口屏障、肛门直肠屏障、阴道屏障和尿道屏障。
在一个实施方案中，至少一个药代动力学参数选自以下至少一个组织大小、组织大小比、组织∶血液体积比、药物停留时间、细胞间相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、细胞的代谢、剪应力、流速、几何形状、循环通过时间、液体分布、组织和/或器官之间的相互作用、和细胞的分子转运。
在一个实施方案中，该方法进一步包括确定物质在通透性材料中、通过通透性材料或被通透性材料的吸收、代谢或分布。在一个实施方案中，部件构造为代表下列至少一个中枢神经、循环、消化、胆道、肺、泌尿、眼、嗅觉、表皮和淋巴系统的至少一部分。
在一个实施方案中，该方法进一步包括在微型装置的内部或外部设置通透性材料。
在一个实施方案中，该方法进一步包括使流体通过与通透性材料连接的至少一个微流通道流动。
在一个实施方案中，流体在通透性材料中、通过通透性材料或靠近通透性材料的流动提供了至少一个药代动力学参数。在一个实施方案中，流体通过该装置流动的特性基于一种数学模型。在一个实施方案中，该数学模型是一种基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将微型部件或通透性材料集成为芯片格式。
在一个实施方案中，通透性材料包括在微孔材料上培养的胃肠肠细胞层。在一个实施方案中，该方法进一步包括定位胃肠肠细胞层的至少一部分，使得所述流体可以沿该层的任一侧流动，但是不通过该层。在一个实施方案中，位于胃肠肠细胞层的第一侧面上的至少第一微型部件代表胃肠道，位于该单层的第二侧面上的至少第二微型部件代表循环系统。在一个实施方案中，第三微型部件构造为含有相同或不同类型的生物材料。
在一个实施方案中，通透性材料包括至少部分包覆有机材料的微孔材料。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将细胞定位于通透性材料之中、之上或靠近其两侧。在一个实施方案中，该方法进一步包括提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。在一个实施方案中，通透性材料任一侧上的细胞为相同的类型或不同的类型。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将肝细胞定位于通透性材料微孔表面之中、之上或附近。在一个实施方案中，该微孔表面的至少一部分包括使肝细胞极化的蛋白质。
在一个实施方案中，通透性材料包括能够形成汇合单层并极化的细胞系。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将肝细胞结合在通透性材料上。在一个实施方案中，该方法进一步包括使肝细胞极化。在一个实施方案中，所述结合包括选自以下至少一种的粘合剂蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将第二种类型的生物材料定位在通透性材料之中、之上或附近。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将成纤维细胞定位在通透性材料之中、之上或附近。
在一个实施方案中，该方法进一步包括使血液替代物靠近通透性材料的第一侧面流动。在一个实施方案中，该方法进一步包括使胆汁替代物靠近通透性材料的第二侧面流动。
本发明的一个实施方案涉及一种形成装置的方法。该方法包括形成一个部件，该部件构造为在如下条件下保持生物材料在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值。该方法进一步包括添加、形成或提供通透性材料。该通透性材料构造为使物质通过通透性材料的至少一部分。
本发明的一个实施方案涉及一种装置，该装置具有在如下条件下保持生物材料的装置以及提供通透性屏障的装置在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值。
本发明的一个实施方案涉及一种装置，该装置包括微型通透性材料和至少一种用于将物质极化的粘合剂，其中该物质表现出肝功能的至少一个特性。
在一个实施方案中，所述物质是一种或多种肝细胞。在一个实施方案中，所述物质是遗传工程生物材料。在一个实施方案中，所述粘合剂将肝细胞结合并极化到微型通透性材料上。
在一个实施方案中，所述装置进一步包括第二种物质类型。在一个实施方案中，所述装置进一步包括一种或多种位于微型通透性材料的至少一个表面附近的成纤维细胞。
在一个实施方案中，微型通透性材料选自有机材料、无机材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一种。在一个实施方案中，微型通透性材料位于微孔表面之中、之上或附近。在一个实施方案中，微型通透性材料构造为模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中通过或穿过，或者物质在生物屏障中、通过生物屏障或被生物屏障吸收。
在一个实施方案中，所述装置由微型通透性材料或通过微型通透性材料处理物质。在一个实施方案中，所述处理进一步包括以下至少一种分子的吸收、提取、排泄、代谢和分配。
在一个实施方案中，微型通透性材料位于所述装置的内部或外部。
在一个实施方案中，所述装置进一步包括至少一个与微型通透性材料连接的微流通道。
在一个实施方案中，流体通过所述装置流动的特性基于一种数学模型。在一个实施方案中，该数学模型是一种基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
在一个实施方案中，所述部件或通透性材料集成为芯片格式。在一个实施方案中，所述装置提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。
在一个实施方案中，所述装置进一步包括位于微型通透性材料之中、之上或靠近其两侧的生物材料。在一个实施方案中，位于微型通透性材料任一侧上的生物材料为相同的类型或不同的类型。
在一个实施方案中，微型通透性材料包括能够形成汇合单层的细胞系。在一个实施方案中，所述粘合剂包括选自下列的至少一种蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
在一个实施方案中，所述装置进一步包括靠近微型通透性材料的第一侧面的血液替代物流动。在一个实施方案中，所述装置进一步包括靠近微型通透性材料的第二侧面的胆汁替代物流动。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，该方法包括将表现出肝功能的至少一个特性的物质以使该物质极化的方式结合到微型通透性材料上。
在一个实施方案中，所述物质是一种或多种肝细胞。在一个实施方案中，所述物质是遗传工程生物材料。
在一个实施方案中，该方法进一步包括提供第二种物质类型。在一个实施方案中，该方法进一步包括将一种或多种成纤维细胞定位于微型通透性材料的至少一个表面附近。
在一个实施方案中，微型通透性材料选自有机材料、无机材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一种。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将微型通透性材料定位于微孔表面之中、之上或附近。
在一个实施方案中，微型通透性材料模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中通过或穿过，或者物质在生物屏障中、通过生物屏障或被生物屏障吸收。
在一个实施方案中，该方法进一步包括由微型通透性材料或通过微型通透性材料处理物质。在一个实施方案中，所述处理进一步包括以下至少一种分子的吸收、提取、排泄、代谢和分配。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将微型通透性材料定位于装置的内部或外部。
在一个实施方案中，该方法进一步包括提供至少一个与微型通透性材料连接的微流通道。
在一个实施方案中，与肝功能的至少一个特性有关的流体流动的特性基于一种数学模型。在一个实施方案中，该数学模型是一种基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将微型通透性材料集成为芯片格式。
在一个实施方案中，该方法进一步包括提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将生物材料定位于微型通透性材料之中、之上或靠近其两侧。在一个实施方案中，位于微型通透性材料任一侧上的生物材料为相同的类型或不同的类型。
在一个实施方案中，微型通透性材料包括能够形成汇合单层的细胞系。在一个实施方案中，所述结合包括提供选自下列至少一种的粘合剂蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
在一个实施方案中，该方法进一步包括提供靠近微型通透性材料的第一侧面的血液替代物流动。在一个实施方案中，该方法进一步包括提供靠近微型通透性材料的第二侧面的胆汁替代物流动。
本发明的一个实施方案涉及一种形成装置的方法。该方法包括形成一种微型通透性材料，该材料构造为结合并且极化表现出肝功能的至少一个特性的物质。
本发明的一个实施方案涉及一种微型设备，该设备具有将表现出肝功能的至少一个特性的物质以使该物质极化的方式结合到微型通透性材料上的设置。
本发明的一个实施方案涉及一种装置，该装置包括微型通透性材料和至少一种构造为表现出肝功能的至少一个特性的物质，其中该物质处理的分子被引导通过微型通透性材料的至少一部分。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，该方法包括将物质处理的分子引导通过微型通透性材料的至少一部分，其中该物质设置为表现出肝功能的至少一个特性。
本发明的一个实施方案涉及一种形成装置的方法。该方法包括形成微型通透性材料，该材料构造为将物质处理的分子引导通过微型通透性材料的至少一部分，其中该物质设置为表现出肝功能的至少一个特性。
本发明的一个实施方案涉及一种装置，该装置具有将物质处理的分子引导通过微型通透性材料的至少一部分的设置，其中该物质设置为表现出肝功能的至少一个特性。



图1是根据本发明的系统的框图。
图2是本发明系统外部的一个实施方案的简化透视图。
图3是本发明系统的另一实施方案的详细示图。
图4是本发明系统的另一实施方案的示意图。
图5A至5G显示用来由塑料制造芯片的步骤。图5A显示用正性光刻胶(photoresist)材料涂覆硅晶片。图5B显示通过光材料将涂覆光刻胶的硅晶片暴露于紫外线。图5C显示曝光的(developing)光刻胶材料。图5D显示蚀刻硅。图5E显示在光刻胶材料上刻纹并且蒸发金。图5F显示电镀镍。图5G显示除去硅并模压聚合物。
图6是本发明系统的另一实施方案的示意图。
图7是详述与芯片结合的计算机的图示。
图8是显示位于外壳内的一个以上芯片的图示。
图9是包括来自不同外壳的一组芯片的系统的图示。
图10是芯片的另一实施方案的图示。
图11是系统的等比例局部分解图。
图12是用于制造与图11所示系统结合的芯片的步骤的等距视图。
图13是与图11所示系统结合的泵的单沟槽弹性体部分的等距视图。
图14是泵的多沟槽弹性体部分的等距视图。
图15是四区室芯片的示意图。
图16是替加氟的剂量应答。芯片在肝区室中接种HepG2-C3A细胞，在靶组织区室中接种HCT-116结肠癌细胞。该芯片用指定浓度的替加氟处理24小时。第一张图(图16A)是在芯片上再循环24小时后死亡细胞百分比相对于替加氟或5-FU浓度的图。第二张图(图16B)是应用48小时暴露，使用HCT 116细胞进行传统体外细胞培养试验获得的类似的剂量应答。将HCT-116细胞接种到聚赖氨酸处理的盖玻片上，并且暴露于指定浓度的替加氟或5-FU。在48小时孵育后，如上所述处理盖玻片，并且确定细胞死亡的百分比。
图17A显示“第一代”三区室装置。图17B显示该装置的横断面视图。
图18A显示“第二代”装置。图18B显示腔室中5μm高的嵴，图18C显示腔室中20μm高的柱。
图19显示“第三代”装置。
图20是五区室PBPK模型CCA的流程图。
图21显示人类生物芯片原型，其含有肺、靶组织和其他组织的区室。区室和通道的尺寸如下 入口1mm×1mm 肝3.2mm宽，4mm长 靶组织2mm宽，2mm长 其他组织340μm宽，110mm长 出口1mm×1mm 连接肝与Y连接的通道440μm宽 从Y连接到靶组织的通道100μm宽 图22显示微型芯片系统的示意图。
图23显示Hep G2、HepG2/C3A和人类肝脏的基础CYP表达水平。来自3个单独测定的标准差。
图24A显示HepG2/C3A在EMEM、DMEM、McCoy′s和RPMI中的生长曲线。图24B显示HCT116在EMEM、DMEM、McCoy′s和RPMI中的生长曲线。来自3个单独测定的标准差。
图25显示在不同生长培养基条件下HepG2/C3A中CYP同种型的表达的RT-PCR测定。
图26显示在不同基底上生长的HepG2/C3A中CYP同种型表达的RT-PCR测定。
图27显示人类生物芯片原型。
图28A是说明根据本发明一个实施方案用于控制微型培养装置的系统的框图。图28B是说明根据本发明另一个实施方案用于控制微型培养装置的系统的框图。
图29是说明根据本发明一个实施方案用于动态控制微型培养装置的计算机化方法的流程图。
图30是说明根据本发明一个实施方案用于控制微型培养装置的计算机的框图。
图31显示在一个实施方案中，在生理参数值类似于体内发现的值的条件下，可以在体外提供和保持第一和第二流体系统之间的相互作用； 图32显示可以在体外模拟各种系统间相互作用的一些实例流体系统的框图； 图33A显示两种流体系统之间的实例相互作用； 图33B显示在一个实施方案中，一种给定的流体系统可以与一种以上的流体系统相互作用； 图33C显示在一个实施方案中，一种给定的流体系统可以与两种以上的流体系统相互作用； 图33D显示在一个实施方案中，流体系统相互作用可以提供再循环功能； 图34A显示双流体系统结构的一种实例实施方案的局部分解图，其中通透性材料可以促进系统间相互作用； 图34B显示图34A的双流体系统的装配图； 图34C显示图34A的双流体系统的俯视图； 图34D显示图34A的系统的一种变形的一个实施方案； 图35A显示三流体系统结构的一种实例实施方案的局部分解图，其中一种或多种类型的通透性材料可以促进两个系统间相互作用； 图35B显示图35A的三流体系统的装配图； 图36显示一种三流体系统实例的框图，其中器官系统显示为与药物递送系统如胃肠(GI)系统和靶系统如脑系统相互作用； 图37显示涉及与肝脏有关的各种系统间相互作用的实例结构的框图，其中这些相互作用可以是再循环过程如肠肝循环的一部分； 图38显示图37的肠肝循环的框图； 图39显示微型通透性装置的一个实施方案，其具有可以促进两个流体系统之间的一个或多个相互作用的通透性材料； 图40A显示微型通透性装置的一个实施方案，其构造为促进血液和胆汁系统之间的相互作用； 图40B显示微型通透性装置的一个实施方案，其构造为促进胃肠和血液系统之间的相互作用； 图41A和41B显示肠肝循环模拟装置的一个实施方案的局部分解图和装配图； 图41C显示图41A的另一局部分解图，其中详细示出了微型通透性装置的一个实施方案； 图42显示图41A和41B的实例肠肝循环模拟装置中可以进行的各种流体流动的示意图； 图43A至43E显示制造图39的微型通透性装置的一个实施方案的各个阶段； 图44显示制造图43A至43D的微型通透性装置的过程的一个实施方案； 图45显示可以由微型通透性装置促进的系统间相互作用的非限制性实例； 图46显示可以由微型通透性装置促进的第一和第二系统之间的系统间相互作用的概括图示；和 图47显示在一个实施方案中，微型通透性装置可以构造为促进在同一层上形成的两个区室之间的系统间相互作用，其中这两个区室是两个不同系统的部分。
在阅读以下的详细描述和参阅附图后，本申请教导的这些和其他方面、优点和新特征将是显而易见的。在这些附图中，类似的元件使用类似的数字标记。
实施方案详述 本发明人开发了一种微型细胞培养模拟(CCA)系统。该微型CCA系统与以前的微型系统相比具有许多优点。该微型系统使用较少量的试剂、较少的细胞(这允许采用真正的原代细胞而不是培养的细胞)、在生理学上更加现实(例如，停留时间、器官比、剪应力)、装置成本更低、尺寸更小(可以进行多种检验和统计学分析)。而且，可以将多个生物传感器集成在同一芯片上。
最简单地，本发明的芯片提供整个动物或人的精确体外替代物。为了实现这一点，使用基于生理学的药代动力学(PBPK)模型—一种将身体表示为互相连接的特定器官特异性区室的数学模型—产生最初的设计。根据PBPK模型和发表的经验数据，长期、广泛的发展计划产生了一种微型装置，该装置精确地模拟了已知的组织大小比、组织∶血液体积比、药物停留时间和整个动物或人的其他重要的生理参数。本质上，本发明的芯片技术是整个动物或人的微型模型(对于人为大约1/100,000)。
在运行中，该装置通过将活细胞分隔为不连续的、相互连接的“器官”区室而复制再循环的多器官系统(参见，例如，图15)。设计流体系统，以精确地模拟循环系统的主要元件和器官系统的相互作用。每个器官区室含有仔细选择的或者工程构建为模拟相应整个器官的主要功能(例如肝脏的生物异源物质代谢)的特定细胞型。细胞型可以是附着的或非附着的，并且来源于标准细胞培养系或原发组织。人细胞用做人类替代物或适当地使用来自其他物种的细胞。
器官区室由作为“血液替代物”起作用的再循环培养基连接。培养基中的受检试剂分布在器官区室中并与其中的细胞相互作用，如同它们在人体中或整个动物中一样。这些化合物和/或其代谢物对各种细胞型的效果通过检测或监测诸如细胞死亡、细胞增殖、分化、免疫应答、或干扰代谢或信号转导途径等关键生理事件来检测。另外，药代动力学数据可以通过收集和分析培养基等份中的药物代谢物来确定。
本发明的微型芯片装置具有传统细胞培养试验在成本和通量方面的优点，以及整体动物模型的高信息含量。但是与整体动物试验不同，该芯片便宜而且大多是一次性的。低流体体积(大约5μl)的装置提供微流体装置的高灵敏度和通量特性。而且，该装置的读数是非常灵活的和独立于试验的——几乎任何细胞型或试验都可以不加改变地使用。可以利用大量基于光学探询(interrogation)和读取的生物测定(例如荧光、发光)，从而使实时监测可行。此外，可以直接使用标准病理学、生物化学、基因组学和蛋白质组学测定，因为该系统可以设计为与传统盖玻片(22mm×22mm)或96孔形式完全相容。此外，遗传工程细胞也可以用于特定的最终用户应用。另外，可以利用包括其他区室和模块的“3D”芯片分析胃肠道或血-脑屏障吸收。
与传统体外试验不同，本发明的芯片更接近地模拟整个生物体的复杂的多组织(肝脏、肺、脂肪、循环系统等)生物学。候选药物暴露于更现实的动物或人类生理环境，因此比典型的体外试验提供更高和更精确的信息内容(例如吸收、分布、生物积累、代谢、排泄、效力和毒性)。这些优点直接影响了对先导药物的安全性和效力的预测，特别是在进入昂贵且耗时的非临床或临床试验之前的优化。这种优化由于允许在进入这些试验之前快速且直接地评价潜在的毒性或有效性的缺乏，而提高了药物开发通量、减少了毒理学筛选所需的动物数量、降低了非临床研究的成本、并且提高了临床试验的有效性。
这些证明了本发明的芯片技术的一些优点。总之，与传统体外细胞培养试验、动物研究或临床试验相比，数据的获得比较快速。数据也是有力的，提供了无法由传统体外试验获得的高度预测性的内容。芯片平台设计为与现有的试验—标准盖玻片或96孔形式—完全相容。装置本身可为任何动物种或多器官区室的组合而构造。单个芯片的价格具有成本效益，是一次性的。而且，该装置的小体积进一步降低了筛选潜在化合物中的试剂成本。
与当前可以利用的技术不同，本发明的芯片系统不仅在临床阶段而且在减少进行临床前试验所需的化合物数量方面大大提高了成功率。因此，制药公司可以(1)在开发过程早期确定哪种候选药物对人类可能具有毒性；(2)较好地选择最佳预测人类应答的动物种；和(3)确定哪种候选药物可能具有有效性。因此，本发明的芯片大大提高了成功率并且缩短了可市场化的药物的开发时间。 基于药代动力学的微型培养装置 提供了用于CCA装置的装置、体外细胞培养物和方法。该方法和装置提供在体外将细胞保持在生理学代表性环境中的设置，由此提高筛选和毒性试验的预测值和体内相关性。本发明的微型药代动力学培养装置在每一培养腔室中接种适当的细胞，然后将该培养系统用于化合物筛选、毒性测定、开发目标细胞的模型、感染动力学模型等。向建立的培养系统中增加输入变量，该变量可以是，例如，化合物、样品、基因序列、病原体、细胞(例如干细胞或祖细胞)。可以评价各种细胞输出，以确定细胞对输入变量的应答，该输出包括培养基的pH、培养基中O2和CO2的浓度、蛋白质和其他细胞标记的表达、细胞存活力、或细胞产物向培养基中的释放。
培养基底或装置的设计和几何形状提供了本发明独特的生长条件。每个装置包括一个或多个腔室，这些腔室通过流体通道互相连接。每个腔室可以具有与该装置中存在的其他腔室不同的几何结构。例如，该装置的一个实施方案由代表肺、肝脏和其他组织的腔室组成(图18A)。为了达到现实的细胞∶液体体积比和液体停留时间，该实施方案中的肺腔室包括5μm高的嵴(图18B)。为了达到现实的细胞∶液体体积比和液体停留时间，该实施方案中的肝腔室含有20μm高的柱(图18C)。该装置还含有入口和出口，使得培养基可以循环。
在一个实施方案中，培养装置是芯片格式，即，腔室和流体通道由制造母版制造或模建，使得该装置形成为单一单元或在单独单元上具有一个或多个腔室的模块系统。通常提供小型的芯片格式，通常侧边不超过大约10cm，或者甚至不超过大约5cm。其侧边甚至可以仅为大约2cm或更小。在另一个实例中，芯片可以以96孔格式嵌入，其中单个芯片小于0.9cm×0.9cm。腔室和流体通道在尺寸上相应地是微型的。
在另一个实施方案中，培养装置是由桌面设备组成的集成装置的形式，该装置中包装有多个制造为基于聚合物的一次性塑料部件的微型芯片。该设备可以包括基底，该基底上具有凹陷部，以容纳各个细胞芯片，或标准96孔格式的单个“芯片”(即，8×12格式的96个单个芯片)。设备顶部在关闭时密封这些芯片并且提供流体互相连通。该设备含有将流体再循环到芯片上的低容量泵，以及具有注射环路的小的三通阀，以提供受试化合物的引入，或者直接从96或384孔板吸取化合物。使用该设备可以同时评价多种化合物的效力、毒性和/或代谢物产生。该设备也可以集成芯片上的荧光检测，以使用良好表征的生物标记进行实时生理学监测。
该装置可以包括从细胞和培养基获得信号的机构。可以实时监测来自不同腔室和通道的信号。例如，生物传感器可以集成到该装置中或者位于其外部，其允许实时读取系统中细胞的生理学状态。
本发明提供一种理想的高通量筛选系统，用于鉴定对许多物质如药物组合物、疫苗制品、细胞毒性化学药品、诱变剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、抑制性化合物、化疗剂和许多其他化合物或因子的阳性或阴性应答。受试物质可以是天然存在的，也可以是合成的，并且可以是有机的或无机的。
例如，细胞毒性化合物的活性可以根据其损伤或杀死培养中的细胞的能力来测定。这可以通过活体染色技术容易地评价。生长/调节因子的效应可以通过分析基质的细胞含量例如通过总细胞计数和细胞分类计数来评价。这可以使用标准细胞学和/或组织学技术来实现，包括使用采用限定类型特异性细胞抗原的抗体的免疫细胞化学技术。可以评价各种药物对在该装置中培养的正常细胞的作用。例如，可以在骨髓培养物上检测提高红细胞形成的药物。例如通过降低胆固醇产量影响胆固醇代谢的药物可以在肝系统上检测。肿瘤细胞的培养物可以作为模型系统，例如，用于检测抗肿瘤剂的效力。
本发明的装置可以用作研究生理学或病理学条件的模型系统。例如，在本发明的一个特定实施方案中，一种装置可以用作血-脑屏障模型；这种模型系统可以用来研究物质通过血-脑屏障的渗透。在另外一个实施方案中，并非作为限制，一种含有粘膜上皮的系统可以用作研究疱疹病毒或乳头瘤病毒感染的模型系统；这种模型系统可以周来检测抗病毒药物的效力。
本发明的装置也可以用来辅助恶性肿瘤和疾病的诊断和治疗。例如，可以从怀疑具有恶性肿瘤的患者中采集任何组织(例如骨髓、皮肤、肝脏)的活检样品。患者的培养物可以在体外用于筛选细胞毒性和/或药物化合物，以鉴定最有效的化合物，即，杀死恶性肿瘤或疾病细胞而放过正常细胞的那些化合物。然后可以用这些试剂治疗性地治疗患者。
在本发明的另一个实施方案中，该装置可以在体外用来高产率地产生生物产物。例如，天然产生大量特定生物产物(例如生长因子、调节因子、肽激素、抗体)的细胞或遗传工程化为产生外源基因产物的宿主细胞可以使用体外装置克隆扩增。如果转化的细胞向营养基质中分泌基因产物，则可以使用标准分离方法(例如HPLC、柱层析、电泳技术，仅以此为例)从消耗的或条件培养基中容易地分离该产物。“生物反应器”可以设计为利用连续流动方法在体外向培养物中补料。实质上，由于新鲜培养基通过装置中的培养物，基因产物将与从培养物中释放的细胞一起从培养物中洗出。基因产物可以从消耗的或条件培养基的流出物中分离(例如，通过HPLC、柱层析、电泳)。
本发明也提供用于筛选或测定各种环境条件或化合物对生物系统的影响的系统。例如，可以在装置中模拟或改变空气或水条件。可以检测不同已知的或怀疑的毒性物质的影响。本发明进一步提供用于筛选消费产品如化妆品、清洁剂或洗液的系统。也提供了用于确定营养品、营养补剂或食品添加剂的安全性和/或效力的系统。本发明也可以作为微型生物反应器或细胞群体平台用于大量产生细胞产品。
使用本发明的芯片格式微型培养装置的典型效力或毒性实验在24-48小时或更短的时间内完成，这取决于实验设计。然而，为了检测长期暴露(例如基因毒性、致癌性或潜伏性疾病)的效果，也可以进行延长的实验。
本发明提供如本说明书所述的新型装置、系统和方法。通常，除非另外明确说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。为了清楚起见，下面列出了本文使用的特定术语的定义来描述本发明。除非另外明确说明，在贯穿本说明书中使用时这些术语使用这些定义。术语的定义 基于药代动力学的培养系统一种体外细胞培养系统，其中细胞保持在提供模拟在体内发现的值的药代动力学参数值的条件下。药代动力学培养装置包含分隔为不连续的但是互相连接的腔室的通道流体网络，其中具体的腔室几何形状设计为提供与体内发现的相应细胞、组织或器官系统的参数相关的细胞相互作用、液体流动和液体停留参数。该装置接种适合所模拟的条件的细胞，例如在基于肝脏的培养腔室中接种肝细胞、在基于肺的培养腔室中接种肺细胞，等等，以提供培养系统。
本发明的培养系统提供与在体内获得的目标细胞、组织或器官系统的值相当的至少一个药代动力学参数值，优选至少两个参数值，并且可以提供三个或多个相当的参数值。感兴趣的药代动力学参数包括，例如，细胞之间的相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、细胞的代谢、或剪应力。
相当的值是指实际值与理论值偏离不超过25％。例如，大鼠的肺区室中液体停留时间的计算值或理论值为2秒，而在大鼠CCA装置的肺细胞培养腔室中测定的实际值为2.5+/-0.7秒。
药代动力学参数值利用PBPK模型方程获得。该方程在本领域中已有描述，例如，参见，Poulin和Theil(2000)J Pharm Sci.89(1)16-35；Slob等人.(1997)Crit Rev Toxicol.27(3)261-72；Haddad等人.(1996)Toxicol Lett.85(2)113-26；Hoang(1995)Toxicol Lett.79(1-3)99-106；Knaak等人.(1995)Toxicol Lett.79(1-3)87-98；以及Ball和Schwartz(1994)Comput Biol Med.24(4)269-76，引入本文作为参考。药代动力学参数也可以从发表的文献中获得，例如，参见Buckpitt等人，(1984)J.Pharmacol.Exp.Ther.231291-300；DelRaso(1993)Toxicol.Lett.6891-99；Haies等人，(1981)Am.Rev.Respir.Dis.123533-541。
感兴趣的具体生理学参数包括组织或器官的液体停留时间、组织或器官质量、液体∶细胞体积比、细胞剪应力等。生理学相关参数值可以按照常规方法根据经验获得，或者可以从本领域已知的和可公开获得的值获得。获得动物、通常是哺乳动物的目标药代动力学参数值，尽管也可以使用其他动物模型，例如，昆虫、鱼、爬行动物或禽类。哺乳动物包括实验动物，例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠，具有经济价值的哺乳动物，例如，马、绵羊、山羊、牛、犬或猫；灵长类动物，包括猴、猿或人类；等等。对于不同年龄的动物，例如，胚胎、新生、婴幼、幼年、成年或老年期动物；以及对于不同的生理状态，例如，患病、接触药物活性剂后、感染后、或在大气压改变的条件下，可以获得并且使用不同的值。
在培养系统的数据处理部件中任选地提供与药代动力学参数值有关的信息以及适用于将在该系统中模拟的各种物质的质量平衡方程，例如，存储于通用存储器中的查阅表，等等。这些方程代表用于该系统中各种生物/化学物质的基于生理学的药代动力学模型。
药代动力学培养装置本发明的培养装置为细胞生长提供基底。每个装置含有至少一个腔室，通常至少两个腔室，并且可以含有三个或多个腔室，其中这些腔室通过流体通道相互连接。这些腔室可以设置在一个基板上，也可以设置在不同的基板上。优选地，每个腔室具有与该装置上的其他腔室不同的几何结构。该装置具有一个密封腔室和通道的盖子，并且具有允许培养基再循环的至少一个入口和一个出口。该装置含有泵送培养基通过该系统的机构。培养基设计为保持培养的细胞的存活力。该装置含有可以将受试化合物导入系统中的机构。
在本发明的一个实施方案中，该装置微型地制造为侧边不超过大约2.5cm的单一单元，优选地包含至少两个互相连接的腔室。两个器官区室通过大约50-150μm宽、15-25μm深的通道连接。例如，一个腔室可以代表肺，包含相互连接的平行通道的阵列，通常是至少大约10个通道，优选地至少大约20个通道。这些通道可以具有典型的微流尺寸，例如大约30-50μm宽、5-15μm深和3-7mm长。另外一个区室可以代表肝，包含两个或多个平行的通道，通常大约50-150μm宽、15-25μm深和5-15cm长，为蛇形。
该装置通常包括用于从细胞和培养基中获得信号的机构。可以实时监测来自不同腔室和通道的信号。例如，生物传感器可以集成在该装置中或者位于其外部，其允许实时读取系统中细胞的生理状态。
本发明的药代动力学培养装置可以作为芯片或基板提供。除了提高流体动力学以外，这些微系统还节省空间，特别是在高度平行的系统中使用时，并且可以便宜地产生。该培养装置可以由诸如但不限于聚苯乙烯的聚合物形成，并且在使用一次后丢弃，不需要灭菌。因此，体外子系统可以便宜地生产并且广泛地应用。另外，细胞可以以三维方式生长，例如，形成管形物，该管形物更接近地复制体内环境。
为了模拟动物对任何特定试剂的代谢应答，平行或多路阵列库包含多个(即至少两个)细胞培养系统，其中每个系统可以相同，或者可以随预定的参数值或输入试剂和浓度而不同。该阵列可以包含至少大约10个、甚至多达100个或更多系统。有利地，微芯片上的细胞培养系统可以容纳在单个腔室内，使得所有细胞培养系统在测定过程中暴露于相同的条件下。
此外，多个芯片可以互相连接，形成单个装置，例如，模拟胃肠屏障或血脑屏障。
细胞在本发明的试验中使用的细胞可以是一种有机体、来源于一种有机体的单细胞型，并且可以是细胞型的混合物，如体内环境典型的情况。培养条件可以包括，例如，温度、pH、因子的存在、其他细胞型的存在，等等。可以使用多种动物细胞，包括如前所述可以获得其药代动力学参数值的任何动物。
本发明适合应用任何细胞型，包括原代细胞、干细胞、祖细胞、正常的、遗传修饰的、遗传改变的、无限增殖化的、和转化的细胞系。本发明适合应用单细胞型或细胞系，或者与不同细胞型组合。优选地，培养的细胞保持对刺激应答的能力，该刺激在其天然存在的对应物中引起应答。这些细胞可以来源于所有来源，例如真核细胞或原核细胞。真核细胞实际上可以是植物或动物细胞，如人、猿或啮齿类动物细胞。它们可以是任何组织型(例如心脏、胃、肾、肠、肺、肝、脂肪、骨、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、骨髓、肌肉、脑、胰)和细胞型(例如上皮、内皮、间质、脂肪细胞、造血细胞)的。此外，也可以使用组织或器官的横截面。例如，也可以使用动脉、静脉、胃肠道、食道或结肠的横截面。
另外，本发明可以使用经遗传改变或修饰为含有非天然“重组”(也被称为“外源”)核酸序列或者通过反义技术修饰为提供遗传功能增加或损失的细胞。产生遗传修饰的细胞的方法在本领域中是已知的，参见，例如“Current Protocols in Molecular Biology，”Ausubel等人，eds，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，2000。细胞可以最终分化或不分化，如干细胞。本发明的细胞可以是来自多种遗传学上不同的个体的培养的细胞，这些个体对生物剂和药剂可以有不同的应答。遗传多样性可以间接和直接地影响疾病易感性。在直接影响的情况下，甚至导致单核苷酸多态性(SNP)的单核苷酸改变也可以改变蛋白质的氨基酸序列，并且直接贡献于疾病或疾病易感性。例如，某些APO-载脂蛋白E基因型与某些个体中阿尔茨海默病的发病和进展有关。
当某些多态性与特定疾病表型相关时，可以研究来自被鉴定为多态性载体的个体的细胞的发育异常，使用来自非载体的细胞作为对照。本发明提供用于研究与特定遗传疾病表现有关的发育异常的实验系统，因为几种不同的细胞型可以同时研究，并且与相关的细胞进行关联。例如，在装置中可以使用神经元祖细胞、神经胶质细胞或神经来源的其他细胞来表征化合物对神经系统的细胞效应。也可以建立系统，从而可以研究细胞，以鉴定影响药物敏感性、趋化因子和细胞因子应答、对生长因子、激素和抑制剂的应答、以及对受体表达和/或功能改变的应答的遗传元件。该信息在设计对于基因来源的或具有遗传倾向的疾病的治疗方法方面可能是非常有价值的。
在本发明的一个实施方案中，细胞与药物活性化合物的解毒和代谢有关，例如肝脏细胞，包括肝细胞；肾细胞，包括肾小管细胞；脂肪细胞，包括可以长时间保持有机化合物的脂肪细胞。这些细胞可以与参与呼吸和供氧过程的细胞如肺细胞在培养系统中组合。这些细胞也可以与对目标试剂损伤特别敏感的细胞组合，例如肠上皮细胞、骨髓细胞和其他快速分化的正常细胞，用于影响细胞分化的试剂。神经细胞可以用来监测试剂对神经毒性的影响，等等。
肿瘤的生长特征和周围组织和免疫系统对肿瘤生长的应答也是有意义的。可以研究退行性疾病，包括受影响的组织和周围的区域，来确定受影响的组织的应答以及与身体其他部分的相互作用。
术语“环境”或“培养条件”包括细胞、培养基、因子、时间和温度。环境也可以包括药物和其他化合物，特别是大气条件、pH、盐组成、矿物质等。细胞培养一般在模拟生理条件的无菌环境中进行，例如，在37℃下在含有潮湿92-95％空气/5-8％CO2大气的孵箱中进行。细胞培养可以在含有不确定的生物液体如胎牛血清的营养混合物中或完全确定的和不含血清的培养基中进行。有多种培养基在本领域中已知，并且可以从商业上获得。
如本文使用的术语“生理条件”定义为表示非常具体地监测细胞培养条件，以尽可能接近地模拟体内特定细胞型的天然组织条件。这些条件包括诸如液体停留时间(即液体在器官中滞留的时间)、细胞∶血液体积比、对细胞的剪应力、与天然器官相当的区室大小等参数。
筛选试验药物、毒素、细胞、病原体、样品等在本文中通称为“输入变量”，通过将其加入基于药代动力学的培养系统中，然后评价培养的细胞的目标输出变量例如O2消耗、CO2产生、细胞存活力或目标蛋白质表达的变化，来筛选其生物活性。输入变量一般以溶液或易溶形式添加到细胞培养基中。输入变量可以使用流通(flow-through)系统添加，或者向静态溶液中添加大丸剂。在流通系统中，使用两种流体，其中一种是生理中性溶液，另一种是加有受试化合物的相同溶液。第一流体在细胞上通过，然后是第二流体。在单溶液方法中，向围绕细胞的基质体积中添加受试输入变量的大丸剂。培养基的总组成应当不随大丸剂的添加而显著变化，或者在流通方法中，在两种溶液之间没有显著变化。
优选的输入变量制剂不包括对总体制剂具有显著影响的额外的成分，如防腐剂。因此，优选的制剂包括生物活性剂和生理学可接受的载体，例如水、乙醇或DMSO。然而，如果试剂是不含赋形剂的液体，则该制剂可以仅是化合物本身。
优选的输入变量包括但不限于病毒、病毒颗粒、脂质体、纳米颗粒、可生物降解聚合物、放射性标记的颗粒、放射性标记的生物分子、毒素偶联的颗粒、毒素偶联的生物分子、和与稳定剂偶联的颗粒或生物分子。“稳定剂”是用来稳定化药物并提供控制释放的试剂。这些试剂包括明矾、聚乙二醇、聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
可以用不同的输入变量浓度平行地进行多种测定，以获得对各种浓度的不同的应答。本领域中已知，确定试剂的有效浓度一般使用从1∶10或其他对数规模的稀释度产生的浓度范围。必要时，该浓度可以进一步用第二系列的稀释度优化。一般使用这些浓度中的一个作为阴性对照，即零浓度或低于检测水平以下。
目标输入变量包括大量化学类别，但通常是有机分子。一个优选的实施方案是使用本发明的方法根据毒性筛选样品，例如环境样品或药物。候选试剂可以包含与蛋白质的结构相互作用(特别是氢键键合)所需的官能团，一般包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。候选试剂通常包含环碳或杂环结构和/或被一个或多个上述官能团取代的芳香族或多环芳香族结构。候选试剂也可以是生物分子，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、其结构类似物或其组合。
包括药理活性药物和遗传活性分子。目标化合物包括化疗剂、抗炎剂、激素或激拮抗剂、离子通道修饰剂、神经活性剂。适合本发明的药剂的例子描述于″The Pharmacological Basis ofTherapeutics，″Goodman和Gilman，McGraw-Hill，New York，N.Y.，(1996)，第九版，以下章节Drugs Acting at Synaptic andNeuroeffector Junctional Sites；Drugs Acting on the CentralNervous System；AutacoidsDrug Therapy of Inflammation；Water，Salts and Ions；Drugs Affecting Renal Function and ElectrolyteMetabolism；Cardiovascular Drugs；Drugs AffectingGastrointestinal Function；Drugs Affecting Uterine Motility；Chemotherapy of Parasitic Infections；Chemotherapy ofMicrobial Diseases；Chemotherapy of Neoplastic Diseases；DrugsUsed for Immunosuppression；Drugs Acting on Blood-FormingOrgans；Hormones and Hormone Antagonists；Vitamins，Dermatology；and-Toxicology，均引入本文作为参考。也包括毒素和生物及化学战剂，例如，参见Somani，S.M.(Ed.)，″ChemicalWarfare Agents，″Academic Press，New York，1992。
受试化合物包括上述所有类别的分子，可进一步包括未知内含物的样品。尽管许多样品在溶液中包含化合物，但是也可以测定可以溶解在适当溶剂中的固体样品。目标样品包括环境样品，例如地下水、海水或采矿废物；生物样品，例如由作物或组织样品制备的裂解物；制造样品，例如药物制备过程中的时程；以及为了分析而制备的化合物文库；等等。目标样品包括评价其潜在治疗价值的化合物，例如来自植物或真菌细胞的候选药物。
术语“样品”也包括已添加额外成分(例如，影响离子强度、pH或总蛋白质浓度的成分)的上述流体。另外，也可以处理样品，以实现至少部分分离或浓缩。如果必须减少化合物的降解，则可以贮存生物样品，例如贮存在氮气下、冷冻或它们的组合。使用的样品的体积足以允许可检测到，通常约0.1μl至1ml生物样品就足够了。
化合物和候选试剂从多种来源获得，包括合成或天然化合物文库。例如，可以利用大量手段随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。此外，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库可以获得或者易于产生。另外，天然或合成产生的文库和化合物易于通过常规化学、物理和生物化学手段修饰，并且可以用来产生组合文库。已知药剂可以经历定向或随机化学修饰，如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化，以产生结构类似物。
输出变量输出变量是细胞的可定量部分(element)，特别是可以在高通量系统中精确测定的部分。输出可以是任何细胞成分或细胞产物，包括，例如，存活力、呼吸、代谢、细胞表面决定簇、受体、蛋白质或其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、mRNA、DNA或来源于这种细胞成分的一部分。尽管大多数输出提供定量读数，但是在一些情况下，获得半定量或定性结果。读数可以包括测定的单个值，或者可以包括平均值、中值或方差。典型地，每个输出将获得一定的读数值范围。使用标准统计学方法预测可变性，并且可以确定一组受检输出的数值范围。
可以利用多种方法定量所选标记的存在。为了测定存在的分子的量，一种常规方法是用可检测部分标记该分子，该可检测部分可以具有荧光、发光、放射性或酶活性。荧光和发光部分易于标记实际上任何生物分子、结构或细胞型，免疫荧光部分不仅可以被引导与特定蛋白质结合，而且可以结合特定构象、切割产物或位点修饰，如磷酸化。各个肽和蛋白质可以改造为自发荧光(autofluoresce)，例如通过在细胞内表达为绿色荧光蛋白嵌合体(关于综述，参见Jones等人.(1999)Trends Biotechnol.17(12)477-81)。
输出变量可以利用免疫测定技术测定，例如免疫组化、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)和相关的非酶技术。这些技术利用特异性抗体作为报道分子，由于这些抗体具有附着于单个分子靶标的高度特异性，因此是特别有用的。基于细胞的ELISA或有关的非酶或基于荧光的方法使得细胞表面参数的测定成为可能。这些试验的读数可以是与单个荧光抗体-检测的细胞表面分子或细胞因子有关的荧光平均值，或平均荧光强度、荧光强度中值、荧光强度方差、或它们之间的一定的关系。
数据分析筛选试验的结果可以与从参照化合物、浓度曲线、对照等获得的结果进行比较。结果的比较利用适当的演绎法、A1系统、统计学比较等实现。
可以汇编参照输出数据的数据库。这些数据库可以包括来自已知试剂或试剂组合的结果，以及分析在环境条件下处理的细胞得到的参照，在该环境条件中除去或具体改变了一个或多个环境条件或参数。可以产生数据矩阵，其中数据矩阵的每一个点对应于来自输出变量的读数，其中每个输出的数据可以来自重复测定，例如同一类型的多个个体细胞。
读数可以是平均值、中值或方差或其他通过统计学或数学方法得到的与测量有关的数值。输出读数信息可以通过与相应的参照读数直接比较而进一步优化。在相同条件下获得的每一输出的绝对值将显示在活生物系统中固有的变异性，并且也反映了个体细胞变异性，以及个体之间固有的变异性。
细胞培养和细胞培养装置 本发明的培养装置包括通道的微流网络，这些通道分隔为一个或多个不连续的但是互相连接的腔室，优选地集成为芯片格式。设计特定的腔室几何形状，以提供与体内发现的相应细胞、组织或器官系统的参数有关的细胞相互作用、液流和液体停留参数。
可以通过重复检测响应液流和尺寸变化的参数值的程序，直到获得选择的值，来开发优化的腔室几何形状。基底的优化包括选择腔室数、选择提供适当细胞∶体积比的腔室几何形状、选择提供适当组织或器官比的腔室大小、选择提供正确液体停留时间的最佳流体流速，然后基于这些值计算细胞剪应力。如果细胞剪应力高于最大允许值，则选择新的参数值，并重复该过程。CCA装置的另一实施方案包括在空心管内而不是在通道或腔室的底部和侧面上生长细胞。已经证明在这种三维组织构建体中生长的细胞比某些体内组织更真实(Griffith(1998)PhARMA Biol.Biotech.Conf.，Coronado，Calif.，March15-18)。
在产生三维培养装置时考虑三个主要的设计参数。第一个是流体与特定组织接触或在孔内的停留时间。停留时间选择为反映血液保持与器官组织接触的时间长度，该器官组织由循环系统的一个通路中的孔代表。第二个是细胞在其中生长的管的半径。例如，用于复制肝的管的半径在200-400μm范围内。应当注意到如果管的半径太大，则细胞实际上将会遇到平面，并且将在管上形成单层。
第三个参数是到达每一模块的流动的比例。调节流动通道的几何形状可将来自腔室的流动分配。通往每个模块或腔室的通道或管一般具有不同的长度，以平衡压降并且平衡流动。在流体离开其他组织后，它可以被泵再循环。通过管的流速根据管的尺寸和停留时间计算。得出流速后，计算对细胞的剪应力，以确保该值不大于细胞应力的限度。肺组织中需要的极短的停留时间使得不可能对该器官使用孔和管的方法。剪应力太高，因此肺组织部分保持流过(flow-over)肺组织单层。
由于本发明的系统是交互的(即计算机不仅感知而且控制试验的条件)，因此可以对该系统进行动态校正，并且适当地观察并记录，向研究人员报告所进行的检测的动力学。
计算机收集的数据由连续联机监测从每个区室流出的受试化学物质所需的数据集合组成。传感器，优选流通型传感器，与从每个区室的流出物对齐布置，由此检测、分析和提供关于从每个区室流出的受试化学物质的定量数据。
微处理器也可以用来计算特定受试化学试剂的基于生理学的药代动力学(PBPK)模型。这些计算可以作为设置区室之间的流速和受试化学试剂从系统中排出的速度的基础。然而，它们也可以作为受试化学试剂的理论估计值。在实验结束时，可以将通过PBPK测定进行的关于受试化学试剂和代谢物浓度的预测与传感器数据进行比较。硬拷贝输出将PBPK模型与实验结果进行比较。
已经构建并检验了几种原型CCA系统。图17A示出了“第一代”三区室装置。其尺寸如下晶片为2cm×2cm；肺腔室具有20个通道(5mm长)40μm×20μm(w×d)；肝腔室具有2个通道(100mm长)100μm×20μm(w×d)。使用该装置的第一步是使用注射泵注射流体，直到充满所有通道。第二步，利用蠕动泵再循环该流体。图17B示出该装置的横截面视图，证明了该系统的流体学。发现400μm厚的弹性体获得良好的密封，有机玻璃(plexiglass)和凝胶加样吸嘴比其他材料脆性更低。该装置存在高压降和在90°弯曲时发生渗漏的问题。
使用这种“第一代”装置进行细胞附着研究。L2细胞置于肺腔室中，H4IIE细胞置于肝腔室中。聚-D-赖氨酸吸附到腔室表面上以促进细胞在通道内的附着。遗憾的是，细胞附着在沟槽的外部，因此检测了不同的基板，并修饰了表面。
图18A显示“第二代”装置。其尺寸如下芯片为2cm×2cm；蚀刻深20μm；肺腔室为2mm×2mm(w×l)；肝腔室为7.5mm×10mm(w×l)。肺腔室含有5μm高的嵴来提高细胞附着(图18B)，肝腔室含有20μm高的柱来模拟渗透(图18C)。
图19显示了“第三代”装置。其尺寸如下芯片为2cm×2cm；肺腔室为2mm×2mm(w×l)；肝腔室为3.7mm×3.8mm(w×l)；“其他组织”腔室为7mm×7mm(w×l)。流体从肺腔室分流，20％流往肝，80％流往其他组织腔室。为了减少压降，腔室的某些部分(虚线)深100μm，其余部分(实线)深20μm，以获得现实的液体∶细胞比。
图20是五区室PBPK模型CCA的流程图。该装置增加了脂肪细胞的腔室、缓慢灌注的流体和快速灌注的流体的腔室。这种装置可以用于生物累积研究、细胞毒性研究和代谢活性研究。可以开发其他具有各种排列的装置。例如，可以增加具有气体交换的隔膜泵，或联机生物传感器，或微型机电(MEM)泵，或生物传感器和电子界面。可以开发一种装置来模拟药物的经口给药。此外，也可以开发一种装置来模拟血脑屏障。 制造 细胞培养装置一般包括单独元件例如腔室、通道、入口或出口的集合体，当它们适当配合或连接在一起时，形成本发明的培养装置。优选地，以集成的、“基于芯片”的格式提供这些元件。
根据装置的尺寸适当地确定装置的流体学的规模。在基于芯片的格式中，流体连接是“微流体的”，这种系统含有流体元件，如至少一个内部横截面尺寸例如深度或宽度大约为0.1μm至500μm的通道、腔室或导管。在本发明的装置中，腔室之间的通道一般包括至少一个微型通道。
微流装置一般包括顶部、底部和内部，其中内部实际限定了该装置的通道和腔室。在优选的方面，底部包括在结构上基本为平面的固体基底，其具有至少一个基本上扁平的上表面。可以使用多种基底材料作为底部。一般地，由于该装置是微制造的，通常基于它们与已知微制造技术的相容性来选择基底材料，这些微制造技术例如是光刻法、薄膜沉积法、湿式化学蚀刻法、活性离子蚀刻法、感应耦合等离子体深硅蚀刻法、激光消融、空气磨损技术、注射成型、压印法(embossing)和其他技术。
本发明的基底材料包括聚合材料，例如塑料，如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(TEFLONTM)、聚氯乙烯(PVC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚砜等。这些基板使用众所周知的模制技术如注射成型、压印法或冲压法，或者通过将聚合前体材料在模具内聚合，由微制造母版容易地制造。这些聚合基底材料是优选的，因为它们易于制造、成本低并且是一次性的，并且对大多数极端的反应条件通常是惰性的。这些聚合材料可以包括经过处理的表面，例如衍生化的或涂覆的表面，以提高它们在系统中的应用，例如提供增强的流体方向、细胞附着或细胞分隔。
一般利用上述微制造技术在基底的上表面或底部内制造微流装置的通道和/或腔室，作为微型凹槽或凹痕。然后将微流装置的顶部(该顶部一般包括第二平面基底)的下表面覆盖并且粘接在基底的表面上，在这两个部件的界面处密封该装置的通道和/或腔室(内部)。顶部与底部的粘接可以根据基底材料的性质采用多种已知的方法进行。例如，在玻璃基底的情况中，可以采用热粘合技术，该技术利用升高的温度和压力将装置的顶部与底部粘接。聚合基底可以采用类似的技术粘接，不同之处是使用的温度通常较低，以防止基底材料过度熔化。也可以使用替代方法将该装置的聚合部分粘接在一起，包括声音焊接技术，或者使用粘合剂，例如紫外线可固化的粘合剂，等等。
该装置通常包括泵，如低流速蠕动泵。小口径软管连接到该装置的出口上，通过蠕动泵，并且连接到该装置的入口上，这样形成闭环系统。泵通常以1μL/min数量级的流速运转。泵系统可以是任何流体泵装置，如隔膜，并且可以如上所述集成到CCA装置(基于芯片的系统)或单独的部件上。
该装置可以连接到处理器上或者与处理器界面连接，该处理器存储和/或分析来自每一个生物传感器的信号。该处理器随后又将数据传送给计算机存储器(硬盘或RAM)，软件程序可以使用来自该存储器的数据进一步分析、打印和/或显示结果。
示例性实施方案的描述 在下面对具体实施方案的详细描述中，参照附图，这些附图构成其一部分，其中举例说明了可以实施本发明的具体实施方案。应当理解，在不背离本发明范围的情况下，可以应用其他实施方案，并且可以进行结构改变。
图1是根据本发明的体外系统的框图。模拟肺细胞的腔室102接受来自气体交换装置103的充氧培养基。这些充氧培养基是通过将培养基接触含氧气体以使培养基吸收含氧气体并且解吸含二氧化碳气体而获得的。离开模拟肺细胞的腔室102的培养基类似于哺乳动物中的动脉血106。然后向模拟肝脏的腔室108、模拟其他组织的腔室110、模拟脂肪的腔室112和模拟肾脏的腔室114供应组成动脉血106的含氧培养基。离开模拟肝脏的腔室108、模拟其他组织的腔室110、模拟脂肪的腔室112和模拟肾脏的腔室114的培养基类似于哺乳动物中的静脉血104。如图1所示，对应于静脉血104的培养基返回模拟肺细胞的腔室102中。本发明的系统也包括模拟肠的腔室116和模拟腹腔的腔室118，这两个腔室构成导入受试化合物的部位。在哺乳动物中，废液115从模拟肾脏的腔室114中排出。
图2是本发明的系统200的一个实施方案的简化示意图。系统200包括肺细胞培养腔室210、肝细胞培养腔室212、脂肪细胞培养腔室213、其他组织腔室214和气体交换腔室250。腔室210、212、213、214和250在硅基板上形成，通常被称为芯片230。应当指出，在单个芯片230上可以容纳或形成4个以上的细胞培养腔室。流体路径240连接腔室210、212、213、214和250。
该腔室具有入口211和出口215。入口211位于气体交换腔室250的一端。出口215位于肝细胞培养腔室212的一端。腔室210、212、213、214和250和流体路径240基本上位于入口211和出口215之间。该系统包括用于在系统200中循环流体的泵260。微管270连接出口215和泵260的入口侧。微管271将泵260的出口侧连接到入口211上。细胞培养腔室210、212、213、214、气体交换腔室250、流体路径240和泵260形成系统200。该系统可以包括另外的细胞培养腔室。增加的一个常见的细胞培养腔室是模拟肾的腔室。
图3是本发明另一个实施方案的示意图。在图3中，在芯片230上设置第一信号路径310、第二信号路径320和第三信号路径330。可以在芯片230上的特定位置处从芯片230采集用于监测每个细胞培养系统200的各个方面的信号，并且转移到芯片230的输出。一个例子，芯片230上的信号路径310、320、330是集成的埋入的波导。在这种实施方案中，芯片230可以由硅、玻璃或聚合物制成。波导310、320、330将光线引导到芯片的边缘，转换器312、322、332位于该芯片的边缘上，将光信号转换为电信号。于是可以监测系统200内的细胞的荧光、发光或吸收或所有这些性质，以探询和监测系统200内的细胞。检查荧光需要光源。光源用来探询分子，而信号载体如波导310、320、330或纤维光学装置捕获信号并将其送出芯片230。信号载体310、320、330将光线引导至靠近芯片310、320、330的信号携带部分末端的光电探测器。
图4是本发明的系统200的另一实施方案的示意图。在该实施方案中，生物传感器410、420、430、440、450和460设置在芯片上位于芯片230的每个细胞培养腔室的上游和下游。生物传感器410、420、430、440、450、460监测培养基的氧、二氧化碳和/或pH。这些传感器允许监测系统200并在需要时调节气体水平，以保持健康的环境。另外，如果恰好位于每个细胞区室的上游和下游，生物传感器提供关于细胞代谢和存活力的有用信息。
图5A至5G显示用来制造基于聚合物的一次性芯片230的步骤。硅片20旋转涂覆一薄层光刻胶21(图5A)。光刻胶21通过含有所需特征的光掩膜23暴露于紫外线22(图5B)。暴露于紫外线的光刻胶21在适当的溶剂中洗掉，由此暴露出硅20(图5C)。使用感应耦合等离子体蚀刻系统将硅20蚀刻为所需的深度(图5D)。剩余的光刻胶用适当的溶剂除去(图5E)。极薄的金(或Ti)镀基底24沉积在硅基板20上，产生用于电镀处理的模板，如图5E所示。将样品浸没到氨基磺酸镍型电镀槽中，将镍25电镀到硅模板20上，直到镍的厚度足够，金作为导电层。镍母版脱离金层，金成为镍母版的一部分。这形成了Ni部件25，如图5F所示。电镀速度是电镀电流、模板直径和模板厚度的函数，校正为大约45nm/min。制造后，用显微镜检查部件25，以证实该部件的尺寸。得到的镍部件25必须是均匀的，并且具有所需的形状。将镍母版25和聚合物基板26加热到正好高于该聚合物的玻璃转化温度。镍母版25和聚合物26接触，并且将镍母版25的特征压印到聚合物基板26内。除去镍母版25，由此产生含有原始硅片20的相同特征的聚合物26(图5G)。
图6是本发明的系统200的第三实施方案的示意图。在该实施方案中，生物传感器600、602、604位于芯片230的周围。生物传感器600、602、604用来进一步监测在芯片230上产生的系统200的细胞的状态。有利地，通过将生物传感器600、602、604定位在芯片230的周围，芯片230可以成为一次性的，具有最低的成本，换句话说，生物传感器600、602、604将不会与芯片230一起丢弃。应当指出，生物传感器600、602、604也可以设置在一次性芯片230上。这一特定选择不具有成本效益，因为处理芯片230也导致丢弃生物传感器600、602、604。当生物传感器600、602、604位于芯片230以外时更具有成本效益，因为生物传感器600、602、604可以再次使用而不是每次使用后处理掉。每个生物传感器600、602、604与计算机620的输入连接。
图7是进一步详细说明计算机620的图示。计算机620监测并调节每个芯片230的系统200的运转。计算机620包括设有输入/输出界面700和内部寄存器/高速缓冲存储器702的微处理器。如图所示，微处理器798通过连接器716与键盘704界面连接，通过连接器718与非易失性存储器706、通用存储器708和查阅表710界面连接，并且通过连接器720与打印机/绘图仪记录器和显示器714界面连接。
非易失性存储器706可以为CD可写入存储器、磁带存储器、磁盘驱动器等形式。查阅表710可以在物理上包含通用存储器708的一部分，该部分留出用于存储适合在系统中模拟的各种物质的一组质量平衡方程。这些方程代表系统中用于各种生物/化学物质的基于生理学的药代动力学模型。内部寄存器/高速缓冲存储器702和通用存储器708含有为多个程序指令和特定数据形式的系统程序，用于自动控制每个芯片230的系统200中的实际上每个功能。该计算机也可以控制并调节与系统200连接的泵260。
也可以提供流体流动作为从流量计通过输入/输出界面700到微处理器798的输入。这允许通过调节程序命令精确控制系统内的流体流速，该程序命令分别通过泵控制线传送给泵260。例如，流速在导管58中可以设置为9.5μL/min，通过流量计66为2.5μL/min，通过流量计78为7μL/mm，在导管70中为2.5μL/mm。容器50中的培养基的温度也可以用微处理器798调节，微处理器798通过输入/输出界面700和温度指示器线728接收来自温度探针792的温度测量值。响应于这些信号，微处理器798通过输入/输出界面700和加热线圈控制线730打开及关闭加热线圈790。
细胞培养腔室210和212中的生物和毒理学反应/变化分别用传感器600、602和604检测，并且通过控制线以及输入/输出界面700传送至微处理器798。传感器可以设计为显示特定波长值或范围方面的试验结果。
微处理器798也非常容易适合包括程序，以使研究人员可通过键盘704交互控制。这允许，例如，引导计算机在任何给定时间具体检查任何培养区室的条件。
本发明提供的另一个选择是通过从CD/磁带存储器706中调出信息来调出以前存储的类似实验的检测结果的能力。因此，存储器706可以编程以保存从公开的信息获得的历史数据、从以前用本发明系统进行的试验中收集的数据，或理论计算得出的数据。提供CD/磁带存储器也允许使用该系统作为信息研究工具。例如，基于通过键盘704输入到微处理器798内的选择信息，可以获得关于特定受试化学试剂或特定培养线的研究数据。通过在存储器706中包含或开发大的信息库，研究人员能够更合理地配置并且计划试验。
图8是显示可以容纳在一个外壳800内的一个以上芯片230的图示。外壳800可以是环境腔室，对于外壳内的每个芯片230保持相同的条件。外壳800包括多个芯片位置810、812、814、816。从每个芯片230或芯片位置810、812、814、816的输出是向计算机620的输入。计算机620于是能通过多个芯片230实时监测系统200。
图9是显示检验可包括位于不同外壳800、900中的芯片230组的示意图。对于环境的变化，例如当温度略微升高时等等，可以监测每个芯片230的输出。进一步预期一个外壳中的每个芯片可以在其上具有相同的细胞培养物，或者外壳800中的芯片230可能具有彼此互相连接的芯片，以在外壳内形成哺乳动物的不同部分或相互依赖的器官。
图2-4和6-9所示的芯片230使用两维的细胞培养腔室210、212、213、214。由于三维组织培养结构可能在它们的代谢中更可靠，另一种芯片1000包括三维结构。下面描述了微型结构培养模拟装置(″CCA″)的产生，该装置中以模块形式引入了三维组织。CCA装置或芯片1000引入了用于肺细胞腔室的流过(flow over)途径和用于其他器官的流通(flow-through)途径。下面进一步描述了向CCA设计的流通途径。
图10显示了芯片1000的示意性的流动方式。芯片1000包括四个孔或组织模块。芯片1000包括肺孔1010、肝孔1020、脂肪孔1030和慢灌注孔1040和快灌注孔1050。利用管使流体通过芯片1000循环。泵1060使流体通过管流动。肺孔1010最先接收所有流动。在肺1010之后，流体将分配到四个组织模块中。肝模块获得25％的流动，脂肪模块为9％，慢灌注模块为15％，快灌注模块部分为51％。调节流动通道的几何学可以分配来自肺孔1010的流动。通向每个模块的通道将具有不同的长度，以平衡压降并平衡流动。在流体离开其他组织后，它通过泵1060再循环回肺区室中。每个孔或组织模块1020、1030、1040、1050容纳组织。该组织容纳在孔1020、1030、1040、1050内的微型管1022、1032、1042、1052中。如图10所示，每个孔1020、1030、1040、1050只有一个微型管1022、1032、1042、1052。应当注意，在一个孔中可以放置多个微管。
在操作中，有两种方法可以将三维组织引入CCA装置或芯片1000中。这两种方法都涉及接种后的培养基通过聚苯乙烯或玻璃微型管流动。检测的细胞附着到管的内部，并且聚集为三维组织。收集所述管，捆扎起来，并且置于芯片1000的孔中。每个孔成为器官模块，药物水溶液将流过该模块以接触组织。
允许引入三维组织的第一种方法涉及流通反应器策略。在硅片上形成开口，形成通道，然后使培养基通过该开口。位于开口内表面上的硅为细胞提供支架，细胞聚集为三维组织。为了将该技术应用于聚合物CCA 1000，可以用粘附蛋白质处理聚合物管，或者可以在添加血清的培养基中培养细胞。血清和粘附蛋白质都允许细胞附着到管的内表面上。
第二种方法涉及在HARV微重力反应器中培养细胞。通过将管搭建在旋转反应器的中心，或者通过将自由漂浮的管引入培养基中，细胞在一些管中形成三维聚集物。由于在微重力中生长的细胞的活性提高，这些组织与二维组织或以上述方法形成的组织相比具有优良的功能。在其内部具有组织的管可以根据重量或密度分开，并且置于该装置上。
图11是并入芯片1000的细胞培养模拟装置1100的局部分解等距视图。芯片1000包括肺细胞培养区1010和与肺细胞培养区1010连接的多个孔。这些孔包括肝组织孔1020、脂肪组织孔1030、慢灌注孔1040和快灌注孔1050。含有各种组织的微型管适配在孔1020、1030、1040和1050中。每个孔包括通向与芯片1000连接的弹性体底部1110的输出。弹性体1110是泵的一部分。致动器1120抵压弹性体，产生泵作用，以移动系统1100的流体，或使系统1100的流体通过返回线路1130从该孔循环回肺组织模块1010。玻璃层置于芯片顶部，覆盖肺组织模块1010和各个孔1020、1030、1040和1050。应当注意，通道1021、1031、1041和1051的尺寸为通过各孔1020、1030、1040和1050产生一定的流速。并非调节各通道1021、1031、1041、1051的长度和宽度，预期可以沿通道设置其他流动限流器，从而为各孔1020、1030、1040和1050提供流速的变化性。玻璃顶1140可以用弯曲和伸展的膜代替，并且可以添加柱塞球型阀，以使通道1021、1031、1041和1051中的流动可以通过通道尺寸以外的手段调节。
芯片1100可以由硅制成，但是更加节省成本的是用聚苯乙烯或其他一些合适的塑料制造芯片1000。首先通过常规手段用硅制成每个芯片。然后由硅制成镍母版。换句话说，通过在硅和镍母版上复制模塑聚苯乙烯和硅氧烷弹性体制造芯片1000。当然，制造聚合物芯片的第一步是在硅片上产生芯片。开始时，光刻胶1210层置于硅片1200上。掩膜置于光刻胶1210上。掩膜含有肺组织培养区1010的图案。掩膜允许紫外线通过到达光刻胶，恰好暴露对应于肺区1010的部分。然后曝光光刻胶，产生对应于肺组织培养区1010的开口1211。然后蚀刻具有光刻胶的硅片，在硅片1200内产生肺开口1010。然后从硅片1200上除去光刻胶1210，得到具有肺孔1010的硅片。然后向晶片1200上设置另一层光刻胶1220。将掩膜设置在晶片上。该掩膜允许暴露各孔或用于连接肺孔1010与各孔1020、1030、1040和1050的流体通道，包括1021、1031、1041和1051。该掩膜暴露流体通道区域中的光刻胶。然后曝光光刻胶，除去对应于流体流动通道的暴露的光刻胶。然后将暴露的区域蚀刻为所需的深度。之后，除去剩余的光刻胶1220，得到具有肺孔1010和其他孔1020、1030、1040和1050的硅片1200。下一步是涂布第三层光刻胶1230。将掩膜置于光刻胶上，该掩膜具有对应于各孔1020、1030、1040和1050的开口。掩蔽光刻胶，并且暴露于紫外线，产生对应于各孔的开口。曝光光刻胶，得到孔1020、1030、1040和1050的暴露的硅区。然后蚀刻芯片和光刻胶1230，产生孔1020、1030、1040和1050。用等离子体将对应于组织模块1020、1030、1040、1050的开口蚀刻为大约750微米的深度。然后用KOH再将所述开口湿法蚀刻250微米，形成逐渐变细的端部。KOH将沿着晶面以54.7度的角度蚀刻硅。然后除去光刻胶，形成硅片，可以由该硅片制成镍母版。
将镍电镀到硅芯片上，产生镍母版1250。然后利用镍母版铸塑或压印聚合物基板1000。对于复制模塑法，将聚合物熔化或者溶解在适当的溶剂中，并倾注到镍母版1250上，固化为与用于压印的初始硅芯片相同的形状。关于压印法，参见图5。然后将聚合物芯片1000设置在硅弹性体沟槽1110上。聚合物和硅自封装，使得这些层形成单一单元。气动致动器1120设置在芯片之下，泵送从各个组织模块1020、1030、1040、1050汇集的流体。沟槽每秒将填充0.032微升的流体。致动器然后向硅上推动，使流体通过微管流回肺区室1010。弹性体沟槽1110和致动器1120形成泵260(图12所示)。然后将涂覆弹性体的聚甲基丙烯酸甲酯(PLEXIGLASTM)1140密封到晶体或芯片1000的顶部。
为了平衡当硅氧烷填满液体时产生的压力，除去肺细胞区室1010上的聚甲基丙烯酸甲酯(PLEXIGLASTM)，并且将其替换为硅氧烷膜。该膜随着硅氧烷泵的作用而升降，并保持该装置中的压力平衡。将各个微型管置于孔中，之后将涂覆弹性体的聚甲基丙烯酸甲酯(PLEXIGLASTM)置于芯片1000上。处理微管的机器包括降低并收集特定数量的充满组织的管的粘附臂。该机器将管运送到所述装置，并且将管紧密包装到相应的模块孔1020、1030、1040、1050中。紧密包装允许摩擦力将管保持在合适的位置，而不受细胞培养模拟装置的任何搅拌的影响。这使得在各孔1020、1030、1040、1050中的管周围的液流渗漏减至最小。通过紧密配合，大约5-10％的液流包围住管，并且直接流到硅氧烷基底或弹性体沟槽1110。
图13显示弹性体沟槽。弹性体沟槽是一片硅氧烷弹性体，其中具有基本上为矩形的开口。矩形开口作为来自孔1020、1030、1040和1050的流体的流体储存器。弹性体沟槽1110在一侧具有用数字标记1300标出的开口。返回线路1130的一个末端与弹性体沟槽1110中的开口1300连接，另一个末端与芯片1000的肺孔1010连接。
在另一个实施方案中，用硅氧烷弹性体泵1400代替弹性体沟槽1110，如图14所示。硅氧烷弹性体泵1400设计为在芯片1000上和在数字标记1100所示的整个系统中更精确地再生循环系统流动。泵1400包括第一肺腔室1410和第二系统腔室1412，它们由分别的致动器1420和1422致动。利用多个腔室1410和1412，产生了更具生理学现实的泵送模式，其在芯片1000底部上具有多沟槽弹性体基底。通过在硅氧烷弹性体沟槽1400中产生多个腔室1410和1412，并且具有以特定时间间隔向基底部分上推动的致动器，复制了心脏的泵送作用。
图28A是显示根据本发明一个实施方案的用于控制微型培养装置的系统的框图。在该实施方案中，系统2800包括与控制设备2802连接的第一微型培养装置2806。第一微型培养装置2806包括多个微型腔室(2808、2810、2812和2814)和将腔室相互连接的微流通道，这些微型腔室的几何学模拟与培养基的多种体内相互作用，其中每个腔室包括用于培养基流动的入口和出口。控制设备2802包括从第一微型培养装置2806获得数据并且控制其药代动力学参数的计算机2804。
在另一个实施方案中，在计算机化芯片上形成第一微型培养装置2806。第一微型培养装置2806进一步包括与控制设备2802连接的用于测量腔室中的生理学事件的一个或多个传感器。该传感器包括一个或多个监测培养基的氧、二氧化碳或pH的生物传感器。控制设备2802容纳第一微型培养装置2806，密封第一微型培养装置2806的顶部，以建立微流通道。控制设备2802提供微流体相互连接，使得微流体流进或流出该装置。在另一实施方式中，计算机2804控制选自泵速、温度、实验时间长度和第一微型培养装置2806的数据获取频率的药代动力学参数。在一个实施方式中，计算机2804提供设置屏(set-up screen)，使得操作者也可以手工确定泵速、装置温度、实验时间长度和数据获取频率(例如每15分钟)。在另一实施方式中，计算机2804控制选自流速、腔室几何形状和第一微型培养装置2806中的细胞数的药代动力学参数。在该实施方式中，系统2800提供比完整动物研究和传统组织培养研究更快速、更灵敏的响应。通过控制参数，系统2800不再是基于生理学的。在另一实施方式中，计算机2804进一步控制第一微型培养装置2806中的一个或多个泵，以在腔室(2808、2810、2812和2814)中产生与活体中相当的培养基停留时间。在另一实施方式中，计算机2804进一步控制一个或多个沿微流通道分布的阀，其控制方式与被模拟的活体部分相关的药代动力学参数值一致。
在另一个实施方案中，系统2800进一步包括具有多个微型腔室和将腔室相互连接的微流通道的第二微型培养装置，该微型腔室的几何形状模拟大量与培养基的体内相互作用，其中每个腔室包括用于培养基流动的入口和出口。控制设备2802与第二微型培养装置连接。
图28B是显示用于控制微型培养装置的系统的另一实施方案的框图。在该实施方案中，系统2816包括与控制设备2818连接的第一微型培养装置。控制设备2818包括计算机2804、控制微流体在第一微型培养装置2806的微流通道中循环的泵2820、控制第一微型培养装置2806的温度的加热元件2822、光源2824和检测第一微型培养装置2806内细胞区室发出的荧光发射的光电探测器2826。在一个实施方式中，计算机2804使用测量仪器记录荧光强度数据，该测量仪器的类型选自比色、荧光、发光和放射测量类型。在另一实施方式中，加热元件2822将第一微型培养装置2806保持在37℃的温度。
图29是说明根据本发明一个实施方案用于动态控制微型培养装置的计算机化方法的流程图。在该实施方案中，计算机化方法2900包括程序块2902、2904、2906和2908。程序块2902包括分析来自多个传感器的数据，以测定微型培养装置的多个腔室中的生理学事件。程序块2904包括调节微型培养装置的腔室中的培养基的流速。程序块2906包括检测微型培养装置的腔室中的生理学或毒理学反应。在这种检测后，程序块2908包括改变微型培养装置的一个或多个药代动力学参数。
在一个实施方案中，程序块2906(即检测)包括检测微型培养装置的细胞区室尺寸的变化。在一个实施方式中，程序块2908(即改变)包括改变选自微型培养装置中的细胞间相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、细胞的代谢和剪应力的药代动力学参数。在一个实施方式中，程序块2908包括改变选自微型培养装置中的流速、腔室几何形状和细胞数的药代动力学参数。
在另一个实施方案中，计算机化的方法2900进一步包括优化微型培养装置内的腔室的几何形状，其中这种优化包括选择一些腔室，选择提供适当组织或器官大小比的腔室的几何形状，选择提供适当液体停留时间的最佳流体流速，以及计算细胞剪应力。
在另一个实施方案中，计算机化方法2900进一步包括调节培养基的温度。在另一实施方案中，计算机化方法2900进一步包括检测来自微型培养装置的细胞区室的荧光发射。
在另一个实施方案中，计算机可读介质包括存储在上面的计算机可执行的指令，用于运行上述计算机化方法的各种实施方案。在一个实施方式中，计算机可读介质包括存储器或存储装置。在另一个实施方式中，计算机可读介质包括嵌入载波中的计算机数据信号。
图30是说明根据本发明一个实施方案用于控制微型培养装置的计算机的框图。在该实施方案中，计算机3000包括微处理器3002、通用存储器3004、非易失性存储元件3006、包括与具有一个或多个传感器的微型培养装置之间的界面的输入/输出界面3008，和计算机软件。该计算机软件可在微处理器3002上执行，以调节培养基在微型培养装置的多个腔室中的流体流速，检测在微型培养装置的腔室中的生物学或毒理学反应，并且在检测后改变该微型培养装置的一个或多个药代动力学参数。
在一个实施方案中，非易失性存储元件3006包括从公开的信息中获得的历史数据、从以前进行的试验中收集的数据、或理论计算得出的数据。计算机软件通过将命令经泵控制线路传递给微型培养装置的一个或多个泵来调节流体的流速。在一个实施方式中，计算机软件进一步可在微处理器3002上执行，以调节培养基的温度。计算机软件通过将命令通过加热器线圈控制线路传送给微型培养装置的加热器线圈来调节温度。
在另一个实施方案中，计算机3000进一步包括与通用存储器3004相连的查表存储器，其用于存储代表该系统中各种生物学或化学物质的基于生理学的药代动力学模型的一组质量平衡方程，以及与微处理器3002连接的用于存储计算机软件的高速缓冲存储器。
在另一个实施方案中，输入/输出界面3008进一步包括键盘界面、显示界面和打印机/绘图仪记录仪界面。在一个实施方式中，计算机3000使用这些输入/输出界面连接至键盘、显示器和打印机/绘图仪记录仪外围设备。
实验 以下实施例是为了给本领域技术人员提供如何进行和使用本发明的完整公开内容和说明，并非意在限制本发明的范围。
已经努力确保所使用的数量(例如含量、温度、浓度)的精确性，但是存在一些实验误差和偏差。除非另外说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度；压力是大气压或接近大气压。
方法 实验过程中使用以下方法 细胞培养。细胞从美国典型培养物保藏中心(Manassas，Va.)获得，并且在组织培养箱(95％ O2/5％ CO2)中在推荐的完全生长培养基中繁殖。对于HepG2和HepG2/C3A细胞，推荐的培养基是Eagle极限必需培养基(含有Earle平衡盐溶液、2mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清)(EMEM)。对于HCT116推荐使用含有1.5mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的McCoy′s 5a培养基。
生长曲线。生长曲线如下确定将细胞以初始低密度涂布到35mm培养皿中。每天，用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱壁，并且通过使用血细胞计数仪目视计数细胞测定细胞数。该测定一式三份进行。
逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。细胞在用胶原MATRIGELTM或适当时用聚赖氨酸处理的盖玻片上培养。用胰蛋白酶-EDTA使生长至大约90％汇合单层的HepG2/C3A脱壁，并且于大约500g离心沉淀5分钟。分离RNA并使用RNEASYTM试剂盒(Qiagen)按照生产商手册纯化。成人肝脏总RNA购自Ambion。分离的RNA的量和纯度(260/280nm比)用BIOPHOTOMETERTM分光光度计(Eppendorf)测定。分离的RNA然后与2UDNase I在37℃下孵育25分钟，随后用DNase灭活试剂(Ambion)灭活。
RT反应使用5μg RNA、10μM oligo dT引物的混合物进行，该混合物于72℃加热2分钟，然后在冰上2分钟。接下来，在逆转录酶缓冲液中混合5mM DTT、600μM dNTP混合物、40U rRNasin、200USUPERSCRIPT IITM，在42℃下孵育1小时。
在使用细胞色素P450同工型特异性引物的50μl PCR反应中使用2.0μl第一链cDNA(Rodriguez-Antona，C，Jover，R.，Gomez-Lechon，M.-J.，和Castell，J.V.(2000).Quantitative RT-PCR measurementof human cytochrome P-450sapplication to drug inductionstudies.Arch.Biochem.Biophys.，376109-116)。PCR条件为94℃ 4分钟，然后94℃ 40秒，60℃ 45秒，72℃ 50秒的28个循环，最后于72℃延伸4分钟。
PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上通过电泳分离，通过用SYBR Gold染色进行显示，并与适当的分子量标准比较以确定其真实性。为了对扩增的cDNA进行定量，各15μl PCR反应液用0.1×Tris-EDTA缓冲液稀释，并用终浓度为1∶400的PICOGREENTM(Molecular Probes)染色。在480nm激发和520nm发射下测量荧光。将结果对β-肌动蛋白标准化，从至少两个单独实验中一式三份进行。
细胞生存、死亡和凋亡试验。细胞生存和死亡使用台盼蓝排除法或LIVE/DEAD染色(Molecular Probes)进行确定。台盼蓝(GIBCO)正常情况下从细胞质中排除，通过可见地将死亡或濒临死亡的细胞染色为蓝色而鉴定细胞膜受损的细胞。在实验结束时向芯片装置的再循环培养基中加入1∶1稀释的0.4％(w/v)台盼蓝溶液。在室温下将该溶液通过芯片泵送至废液中30分钟。从泵上除去外壳，在反射显微镜(Micromaster，Fisher)下观察。
LIVE/DEAD染料是由钙荧光素AM和乙锭同型二聚体组成的双组分染料。活细胞活跃地水解钙荧光素AM的乙酰氧甲酯(AM)部分，产生亮绿色的钙荧光素荧光。相反，膜完整性受损的细胞允许正常的非膜透性乙锭同型二聚体将死亡或濒临死亡的细胞的核染色为荧光红色。细胞渗透核染液，Hoechst 33342，作为所有细胞的通用染液。使用的适当的滤光片组，活细胞发绿色荧光，死亡或濒临死亡的细胞发红色荧光，所有细胞都根据蓝色核荧光进行定量。对于本文所述的实验，使用0.2％(w/v)的台盼蓝、1∶20,000的钙荧光素AM、1∶5,000的碘化丙啶、和10μg/ml的Hoechst 33342。细胞用M2Bio立体荧光显微镜(Zeiss)观察。所有实验都至少重复三次，并一式三份进行测定。
细胞凋亡或程序性细胞死亡可以用大量方法进行监测(Smyth，P.G.，Berman，S.A.和Bursztajn，S.(2000).Markers of apoptosismethods for elucidating the mechanism of apoptotic cell deathfrom the nervous system.Biotechniques，32648-665)。为了区别细胞凋亡和坏死，至少需要两种单独的指示剂(Wronslri，R.，Golob，N.和Gryger，E.，(2002).Two-color，fluorescence-basedmicroplate assay for apoptosis detection.Biotechniques，32666-668)。一种方法，膜联蛋白V-FITC结合，依赖于在二价钙存在下膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸紧密结合的发现(Williamson，P.，Eijnde，S.v.d.和Schlegel，R.A.(2001).Phosphatidylserineexposure and phagocytosis of apoptotic cells.In Apoptosis，L.M.Schwartz和J.D.Ashwell，eds.(San Diego，Academic Press)，pp.339-364)。在正常情况下，磷脂酰丝氨酸存在于细胞膜的内小叶上，但是在凋亡早期转位到细胞膜上。暴露于荧光团标记的膜联蛋白的凋亡细胞显示出不同的膜染色。使用微型芯片，直接在芯片上显示膜联蛋白V-FITC标记，包括首先用PBS冲洗该系统，然后再循环膜联蛋白V-FITC(10μg/ml，在膜联蛋白V结合缓冲液中，Clontech)30分钟。然后用FITC滤光片组直接显示细胞。
与膜联蛋白V标记不同，APOPTAGTM试剂盒(Intergen Co.，MA)使用末端脱氧核苷酰转移酶标记在凋亡DNA降解过程中暴露的游离的3′-OH DNA末端，并使用免疫荧光显示(Li，X.，Traganos，F.，Melamed，M.R.和Darzynkiewicz，Z.(1995).Single-step procedure forlabeling DNA strand breaks with flourescein-orBODPY-conjugated deoxynucleotidesdetection of apoptosis andbromodeoxyuridine incorporation.Cytometry 20，172-180)。尽管该方法对于细胞凋亡是高度特异性的，但是由于固定和孵育步骤，该程序不能在芯片上进行。简言之，微型芯片在特定实验条件下运行，将细胞芯片从它们的外壳单元中取出，在1％多聚甲醛中固定，并用APOPTAGTM试剂盒按照生产商的方案处理。
微型芯片制造和实验方法。微型芯片如下制造使用计算机辅助设计(CAD)软件(Cadence)设计一种模式，并且使用GCA/Mann 3600F光学图形发生器产生铬光掩膜。然后通过使用Karl Suss MA6接触光刻机通过光掩膜将晶片暴露于紫外线，将这种高分辨率的图形转移到含有正性光刻胶(Shipley 1813)薄涂层(大约1μm)的硅片上。在暴露后，曝光光刻胶，由此以定义的图案通过光刻胶层暴露了硅。使用PlasmaTherm SLR 770 ICP Deep硅蚀刻系统将暴露的硅蚀刻为特定深度(20至100μm)。使用丙酮从晶片上剥去光刻胶。由晶片切割各22mm2的微型芯片，在Nanostrip(Cyantek)中洗涤，用蒸馏水漂洗，在170℃烘箱中干燥。
器官区室中的硅表面用胶原处理，以促进细胞附着。大约10μl 1mg/ml的I型胶原溶液沉积在微型芯片的表面上，并且在室温下孵育30分钟。除去胶原溶液，器官区室用细胞培养基漂洗。将细胞从组织培养皿上分离，确定细胞数，并且调节浓度使得每个细胞区室中有汇合的细胞单层。例如，对于图2所示的微型芯片(见上文)，10μl 2,400细胞/μl的L2细胞悬浮液沉积在细胞芯片的肺腔室上，15μl 3,400个细胞/μl的H4IIE细胞悬浮液沉积在肝腔室上。使细胞在CO2培养箱中附着过夜。一旦细胞附着，即将芯片装配在丙烯酸芯片外壳中。外壳的顶部含有流体相互连接，以给芯片提供细胞培养基。不锈钢管与微口径泵管连接，并且插入微量离心管顶部的小孔中，该微量离心管含有含或不含受试化合物的培养基。泵管与蠕动泵连接，用该溶液预处理，并且连接到芯片外壳的入口。不锈钢管与末端连接的泵管的一小部分连接到出口，并且该管插入到微管顶部的小孔中，从而实现再循环流体回路。将整个设备置于37℃的CO2培养箱中。该装置的示意图见图22。实施例1 对于复制大鼠系统的计算 在设计芯片1000时，所有必要的腔室配合到不大于2cm×2cm的硅芯片上。这种芯片大小易于制造，并且与连接管和用于引导液流的泵装置的大小匹配。也有几种其他的重要因素限制以下所列装置的设计，以及每个变量的可接受的值。该装置的这样一种实施方案由两区室系统组成，一个区室代表大鼠的肝脏，一个区室代表大鼠的肺。芯片的总大小为2cm×2cm，并且由相互连接的用作“肺”腔室的20个宽40μm、深10μm、长5mm的平行通道和用作“肝”腔室的100μm宽、20μm深、10cm长的两个蛇形平行通道的阵列组成。两个器官区室通过100μm宽、20μm深的通道连接。存在许多其他可能的腔室几何形状、尺寸、数量等。选择这种设计作为一个实例。
表1 样品计算 通道或腔室计算 这些计算假定我们已经通过上述用于系统1100的芯片1000的方法从以前的迭代中获得了流速。
这时，Q＝8.05×105μm3/沟槽-秒。
然后通过以下公式计算液体在沟槽中的停留时间
然后，计算“细胞-长度”中的细胞数 vR＝2.48sec

N长度＝7个细胞(每项分别四舍五入) 然后，计算通道/腔室细胞-长度体积 VTCL＝(细胞直径)·(沟槽横截面面积) VTCL＝(7.41μm)·(7.41μm2) VTCL＝2960μm3 也确定了细胞-长度体积。


VCCL＝1120μm3 液体细胞-长度体积只是从通道/腔室细胞-长度体积中减去细胞的细胞-长度体积。细胞的细胞-长度体积与液体细胞-长度体积的比 值得到该系统的液体∶细胞体积比

比值＝1.65 确定与给定流速有关的对个体细胞的剪应力。基于液体细胞-长度体积和细胞直径，计算液体可以流过的平均表面积。

ALS＝249μm2 然后计算通道中流体的平均线速度。



假定为层流，用斯托克斯定律计算球体上的阻力(drag)，以估计单个细胞经历的总剪应力，

然后，证实液体在通道/腔室中的实际停留时间，并计算通道/腔室中的细胞总数，

N细胞＝9.45×104个细胞 I.B.膜充氧计算 用于充氧的硅氧烷膜的面积按照下列方式确定 首先，大概估计细胞的氧吸收率(OUR)
然后计算膜内部的氧分压，以确定其是否足以给液体培养基再充氧。这使用气体通过多孔膜的流通量的方程式进行，其中Q是膜通透性。J表示气体向细胞内的流通量，z是膜的厚度


该压力足以在接触膜200秒内使液体培养基成为氧饱和的。用迭代法确定膜面积，以使内部氧分压达到最大。
斯托克斯定律3πηDU＝FD(涂布面积是通过实验确定的L2和H4IIE细胞的饱和密度的倒数) 实施例2四器官区室芯片 芯片设计为由四个器官区室组成-代表负责生物异源物质代谢的器官的“肝”区室，代表靶组织的“肺”区室，提供疏水化合物的生物积累部位的“脂肪”区室，以及辅助模拟非代谢、非积累组织中的循环模式的“其他组织”区室(图15)。这些和其他器官区室(例如肾脏、心脏、结肠或肌肉)可以完全模块化为CAD文件，并且可以以任何构造或组合制造。装置本身可以在任意数量的基板(例如硅、玻璃或塑料)中产生。
一旦细胞接种到适当的区室中，芯片将装配在Lucite集合体(manifold)中。这种集合体容纳有4个芯片，并且含有透明顶部，因此能够在原处观察细胞。顶部含有流体相互连接，以给芯片提供细胞培养基。使用蠕动泵以0.5μl/min的流速泵送培养基通过芯片。培养基在由流体储存器(大约15至50μL总体积)、微口径管和芯片的区室和通道组成的密闭环路中再循环。
使用在肝区室中具有人HepG2-C3A细胞、在靶组织区室中具有HT29结肠癌细胞的三区室系统，发现细胞在连续操作大于144小时后仍然存活。HepG2-C3A细胞是一种良好表征的人肝细胞系，已知以相当于新鲜原代人肝细胞的水平表达各种肝脏代谢酶。在这些实验中，将细胞接种在适当的区室中，特别配制的细胞培养基通过该系统再循环可达144小时。在不同时间点，将培养基更换为含有LIVE/DEAD荧光试剂(双荧光染料，[Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.，USA])的PBS，保持30分钟。细胞在荧光显微镜下观察，使用适当的滤光片组获得相同视野的荧光图像。活细胞发绿色荧光，而死细胞为红色(数据未示出)。
实施例3 芯片中的药物代谢 使用含有肝脏、靶组织和其他组织三个区室的微型芯片研究两种广泛应用的前药替加氟(tegafur)和舒林酸亚砜的代谢。两种前药都需要被肝脏中的酶转化为活性代谢物，并且对靶器官具有细胞毒性作用。对于前药舒林酸亚砜，它的抗炎性和化学防癌性质来自于它的硫化物和砜代谢物，由肝脏酶亚砜还原酶催化。硫化物代谢物(和第二种砜代谢物)已经证明在某些癌细胞(例如结肠癌)中诱导细胞凋亡。
一种适当的治疗方案需要施用其前药替加氟[5-氟-1-(2-四氢呋喃基)-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮]，因为5-FU本身对正常细胞毒性极强。然而，与舒林酸不同，替加氟在肝脏中主要被细胞色素P450 2A6转化为5-FU。
为了检验舒林酸的效力，微型芯片在肝区室中接种HepG2-C3A细胞，在靶组织区室中接种HT29人结肠癌细胞。将100微摩尔舒林酸(来自生产商)加入再循环培养基中，保持24小时，并且如上所述处理芯片-活细胞发绿色荧光，死细胞发红色荧光(数据未示出)。在不存在HepG2-C3A肝细胞的情况下，观察到最低水平的细胞死亡(类似于载体对照)。这些结果证实药物在肝区室中可以被代谢，然后循环到靶标中，在该靶标中其代谢物诱导生物效应，几乎如同在活动物或人体中一样。
在微型芯片系统中检测癌症治疗前药替加氟。替加氟需要被肝脏中存在的细胞色素P450酶代谢活化为其活性形式，5-氟尿嘧啶(5-FU)，才能具有效力(Ikeda，K.，Yoshisue，K.，Matsushima，E.，Nagayama，S.，Kobayashi，K.，Tyson，C.A.，Chiba，K.和Kawaguchi，Y.(2000).Bioactivation of tegafur to 5-fluorouracil iscatalyzed by cytochrome P-450 2A6 in human liver microsomes invitro.Clin.Cancer Res.，6，4409-4415；Komatsu，T.，Yamazaki，H.，Shimada，N.，Nakajima，M.和Yokoi，T.(2000).Roles ofcytochromes P450 1A2，2A6，and 2C8 in 5-fluorouracil formationfrom tegafur，an anticancer prodrug，in human liver microsomes.Drug Met.Disp.，28，1457-1463；Yamazaki，H.，Komatsu，T.，Takemoto，K.，Shimada，N.，Nakajima，M.和Yokoi，T.(2001).Ratcytochrome P450 1A and 3A enzymes involved in bioactivation oftegafur to 5-fluorouracil and autoinduced by tegafur livermicrosomes.Drug Met.Disp.，29，794-797)。一种适当的治疗方案需要施用其前药替加氟，因为5-FU本身对正常细胞毒性很强。5-FU是当前最有效的结肠癌患者的辅助治疗剂(Hwang，P.M.，Bunz，F.，Yu，J.，Rago，C，Chan，T.A.，Murphy，M.P.，Kelso，G.F.，Smith，R.A.J.，Kinzler，K.W.和Vogelstein，B.(2001).Ferredoxinreductase affects p53-dependent，5-fluorouracil-inducedapoptosis in colorectal cancer cells.Nat.Med.，7，1111-1117)。象大多数化疗剂一样，5-FU在敏感的细胞中通过产生活性氧诱导明显的细胞凋亡(Hwang，P.M.，Bunz，F.，Yu，J.，Rago，C，Chan，T.A.，Murphy，M.P.，Kelso，G.F.，Smith，R.A.J.，Kinzler，K.W.和Vogelstein，B.(2001).Ferredoxin reductase affectsp53-dependent，5-fluorouracil-induced in colorectal cancercells.Nat.Med.，7，1111-1117)。
为了测定替加氟对结肠癌细胞的细胞毒性效应，准备在肝区室中具有HepG2-C3A细胞、在靶组织区室中具有HCT-116人结肠癌细胞的微型芯片。将不同浓度的替加氟加到再循环培养基中保持24小时，并用膜通透性DNA染料Hoechst 33342和膜不透性DNA染料乙锭同型二聚体标记细胞(见方法部分)。所有细胞都发蓝色荧光，但是死细胞被荧光红色乙锭同型二聚体标记(数据未示出)。在这种微型芯片系统中，替加氟以剂量依赖的方式对HCT-116细胞具有细胞毒性，而在传统的细胞培养试验中无效(图16A和16B)。另外，5-FU在传统的细胞培养试验中引发细胞死亡，直到暴露48小时后才观察到细胞毒性，而与之相比，使用微型芯片在暴露于替加氟24小时后观察到细胞毒性。
为了证实肝区室负责替加氟的生物活化，向微型芯片上只接种HCT-116细胞。在肝区室中没有细胞。向再循环培养基中添加替加氟或5-FU，保持24小时，并且如上所述处理芯片(数据未示出)。在不存在肝区室的情况下替加氟不引起HCT-116细胞的明显的细胞死亡，而活性代谢物5-FU引起实质性的细胞死亡。此外，当用HT-29结肠癌细胞代替HCT-116时，替加氟无效(数据未示出)。这可能是由于在HT-29细胞中存在突变p53，这是5-FU细胞毒性所必需的。总之，这些实验证明了替加氟象舒林酸一样在肝区室中被代谢为活性药物，在其中它被循环到另一个器官区室，清除癌细胞。使用芯片可以机械地区分这些效果-舒林酸甚至在不存在活性p53的情况下仍然有效，而替加氟无效。实施例4 单器官区室中的多细胞培养物 也可能在单器官区室中使用多细胞型的培养物。在一项研究中，在肝区室中使用肝细胞细胞系HepG2/C3A(来自ATCC)。该细胞在含有1.5mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的McCoy′s 5A培养基中繁殖。为了更接近地模拟体内器官，与巨噬细胞(枯否细胞)一起，以1∶2的比例使用原代肝细胞和成纤维细胞的混合物。
在另一个实施例中，使用来源于肺上皮细胞的细胞或细胞系的混合物更接近地模拟肺组织。这包括I型上皮细胞、II型上皮细胞(肺颗粒状细胞)、成纤维细胞、巨噬细胞和肥大细胞的混合物。
实施例5 基于芯片的系统中组织培养条件的优化 发展了与两种不同大鼠细胞培养系H4IIE(大鼠肝细胞系)和L2(大鼠肺细胞系)相容的组织培养基。初步实验表明，在微型芯片中，DMEM和含有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10％胎牛血清(FBS)的Hams F12K培养基的1∶1混合物使H4IIE细胞和L2细胞在高达20小时的连续运行中保持存活力。该培养基制剂用于所有基于大鼠的微型芯片研究。
选择实际模拟人类肝功能的适当的人肝细胞系。另外，确定用于在微型芯片上保持人细胞系的最佳细胞培养基制剂。确定了三种关键细胞色素P450(CYP)同工型(1A2、3A4和2D6)在HepG2和HepG2/C3A(HepG2亚克隆)细胞系中的基础表达水平。检查了CYP-1A2、2D6和3A4，因为它们占所有已知药物的代谢的80-90％(Hodgson，J.，(2001).ADMET-turning chemicals into drugs.Nat.Biotech.，19，722-726)。检查了HepG2肝细胞系的C3A亚克隆，因为已经报道了该细胞系是比亲代细胞系表现更多“肝样”特性、特别是更高的CYP表达的高度选择的细胞系(Kelly，J.H.(1994).Permanent humanhepatocyte cell line and its use in a liver assist device(LAD).美国专利No.5,290,684)。RT-PCR分析证实HepG2/C3A细胞中的基础CYP水平显著高于HepG2亲本并且与成人肝脏相当(图23)。
在所有后面的实验中使用HepG2/C3A细胞作为肝脏替代物。为了选择在微型芯片实验中使用的通用培养基，比较了许多培养基的成分(DMEM、McCoy′s 5a、RPMI1640、MEM、F12、F12K、Waymouth′s、CMRL、MEM和Iscove改良的Dulbecco培养基)。对无机盐、葡萄糖、氨基酸组合物和维生素含量的分析提示EMEM、DMEM、McCoy′s 5a和RPMI是所检查的培养基中最合适的“通用”培养基。在几次传代后，分开细胞，并在以下培养基中亚培养 含有Earle平衡盐溶液、2mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的Eagle极限必需培养基(EMEM)。
含有4mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。
含有1.5mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的McCoy′s 5a培养基(McCoy′s)。
含有2mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.0mM丙酮酸钠、1.5g/L碳酸氢钠的RPMI1640培养基(RPMI)。
然后如方法部分所述确定两种细胞系在每种培养基中的生长曲线(图24)。发现DMEM不适合HepG2/C3A细胞，因为在大约5代后观察到细胞形态学和粘附的显著变化(未显示)。类似地，在RPMI中3天后注意到HepG2/C3A和HCT1116的存活力和生长显著降低。与它们优选的培养基相比，两种细胞系在McCoy′s和EMEM中生长良好。
然后，利用RT-PCR研究(见方法部分)了在生长于EMEM或McCoy′s中的HepG2/C3A细胞中这些CYP同工型的表达水平(图25)。结果表明在保持CYP表达方面EMEM优于McCoy′s和HepG2/C3A优选的培养基。研究了不同生长基底对CYP表达的影响(图26)。用聚-D-赖氨酸或胶原处理的硅作为附着基底与在标准组织培养物处理的聚苯乙烯上生长的细胞进行了比较。总之，结果表明EMEM支持HepG2/C3A和HCT116细胞的生长，并且根据RT-PCR CYP表达分析，胶原是优选的基底。
使用这些条件，在微型芯片系统中在连续运行下研究了细胞HepG2/C3A和HCT116的长期细胞存活力。使用在肝区室中具有HepG2/C3A细胞和在靶组织区室中具有HCT116结肠癌细胞的三区室系统，证明在连续运行长于144小时下细胞仍然存活。在这些实验中，将细胞接种到适当的区室中，EMEM通过该系统再循环可达144小时。在不同时间点(6、24、48、72、96、120和144小时)，总的活细胞或死细胞用LIVE/DEAD染料显示(数据未示出)。细胞在荧光显微镜下观察，使用适当的滤光片组获得相同视野的荧光图像。活细胞发绿色荧光，而死细胞为红色(数据未显示)。 实施例6在微型芯片上检测细胞毒性的试验 台盼蓝是用来区分活细胞和非活细胞的最常用的染料；只有非活细胞吸收该染料并且显示为蓝色。相反，活的、健康的细胞显示为圆形和可折射的，而不吸收蓝色染料。使用台盼蓝进行实验以确定微型芯片中的细胞存活力。尽管台盼蓝(见方法部分)易于使用并且只需要光学显微镜来观察，但是活细胞随着时间延长将吸收台盼蓝，这可能影响结果。另外，台盼蓝对血清蛋白质比对细胞蛋白质具有更高的亲和力，因此当使用含血清基质时背景较暗。因此，研究了区分活细胞与死细胞的替代方法。
使用在盖玻片上生长的细胞优化了LIVE/DEAD试验(见方法部分)。简言之，将HepG2/C3A细胞接种到聚-D-赖氨酸处理的盖玻片上，并用1μM星形孢菌素处理以及不用其处理，保持24小时。星形孢菌素是一种广谱蛋白质激酶抑制剂，已知其可在许多细胞型中诱导细胞凋亡(Smyth，P.G.，Berman，S.A.和Bursztajn，S.(2002).Markersof apoptosismethods for elucidating the mechanism ofapoptotic cell death from the nervous system.Biotechniques，32，648-665)。盖玻片用磷酸缓冲液(PBS)洗涤，加入LIVE/DEAD试剂，并且在室温下孵育30分钟。取出盖玻片，进行显示(数据未显示)。发现星形孢菌素明显导致HepG2/C3A细胞死亡(数据未显示)。
然后优化用于在微型芯片系统上检测细胞毒性的试验。如方法部分所述，微型芯片细胞芯片在肝区室中接种HepG2/C3A细胞，在靶组织区室中接种HCT116细胞。将细胞芯片加到微型芯片系统上，如上所述用1μM星形孢菌素处理以及不处理。孵育24小时后，将再循环培养基更换为PBS，使其通过该系统流向废物30分钟，然后更换为含有LIVE/DEAD试剂的PBS，再流过该系统30分钟。从系统中取出含有细胞芯片的丙烯酸外壳，置于立体荧光显微镜下，通过外壳的透明顶部观察(数据未显示)。在荧光显微镜下观察细胞，使用适当的滤光片组获得相同视野的荧光图像。活细胞发绿色荧光，而死细胞为红色(数据未显示)。与未处理的对照细胞芯片相比，1μM星形孢菌素处理24小时后导致明显的HCT116细胞死亡(数据未显示)。
实施例7 检测细胞死亡发生和区分细胞凋亡或坏死的基于芯片的试验 研究了用于检测细胞凋亡的两种不同的试验。第一种试验是可以作为APOPTAG(Intergen Co.，MA)以试剂盒形式获得的基于免疫荧光的末端脱氧核苷酰转移酶BrdU缺口末端标记(TUNEL)技术(见方法部分)。该试验首先利用在盖玻片上生长的细胞优化。简言之，将HepG2/C3A细胞接种到聚-D-赖氨酸处理的盖玻片上，并用星形孢菌素处理以及不处理。盖玻片如上所述处理(见方法部分)。测试了不同的星形孢菌素浓度和处理时间，结果表明与未处理的对照相比，1μM星形孢菌素在24小时孵育后引起显著的细胞凋亡(数据未显示)。然后，优化用于在微型芯片系统上检测细胞凋亡的试验，并进行APOPTAG法和LIVE/DEAD染色技术的比较。如方法部分所述，微型细胞芯片在肝区室中接种HepG2/C3A细胞，在靶组织区室中接种HCT116细胞。如上所述，将细胞芯片加到微型芯片系统上，并用1μM星形孢菌素处理以及不处理。24小时孵育后，将再循环培养基更换为PBS保持30分钟。从外壳中取出一半细胞芯片，并且如上所述进行APOPTAGTM试验。其余的细胞芯片保留在微型芯片系统中，如前所述进行LIVE/DEAD染色技术。细胞在荧光显微镜下观察，使用适当的滤光片组获得相同视野的荧光图像。活细胞发绿色荧光，而死细胞为红色(数据未显示)。两种技术产生极其相似的结果，即，与未处理的对照相比，暴露于1μM星形孢菌素24小时诱导HCT116细胞的显著的细胞凋亡(或细胞毒性)(数据未显示)。
如方法部分所述利用膜联蛋白V-FITC在微型芯片系统中检测细胞凋亡。简言之，微型芯片细胞芯片在肝区室中接种HepG2/C3A细胞，在靶组织区室中接种HCT116细胞。如上所述将细胞芯片加到微型芯片系统上，并用1μM星形孢菌素处理以及不处理。6小时孵育后，将再循环培养基更换为含有膜联蛋白V-FITC和Hoechst 33342的PBS，使其通过该系统流动30分钟。从丙烯酸外壳中取出细胞芯片，在荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下观察细胞，使用适当的滤光片组获得相同视野的荧光图像。活细胞发绿色荧光，而死细胞为红色(数据未显示)。与未处理的对照细胞芯片相比，1μM星形孢菌素在6小时处理后引起显著的细胞凋亡(数据未显示)。
实施例8 萘作为模型毒物的应用 利用萘研究了毒理学，因为肺毒性需要在肝脏中进行酶转化。因此，研究了萘对大鼠肺细胞系的影响。这些实验使用基于大鼠的三区室(肝、肺和其他组织)微型芯片，在肝区室中具有H4IIE细胞，在肺区室中具有大鼠L2细胞。如方法部分所述制造并准备微型芯片用于实验。
微型芯片系统在存在或不存在250μg/ml萘的条件下运行20小时，之后更换为含有台盼蓝的PBS。该溶液通过细胞芯片再循环30分钟，在光学显微镜下观察芯片(参见方法部分)。萘导致细胞芯片的肺区室中大鼠L2细胞的显著的细胞死亡，而在不存在萘的情况下未观察到细胞死亡(数据未显示)。在含有或不含萘的H4IIE细胞区室中或者在不含H4IIE细胞的L2细胞区室中未观察到细胞死亡(数据未显示)。
这些结果证明萘在“肝”区室中被活化，毒性代谢物循环到“肺”中，并且导致细胞死亡。这些结果与使用台式CCA装置获得的以及从PBPK模型预测的数据一致(Sweeney，L.M.，Shuler，M.L.，Babish，J.G.和Ghanem，A.(1995).A cell culture analogue of rodentphysiologyapplication of napthalene toxicology.Toxicol.inVitro，9，307-316)。
实施例9 人类微型芯片原型 制造含有肺、靶组织和其他组织的区室的人类生物芯片原型。区室和通道的尺寸如下 入口1mm×1mm 肝3.2mm宽，4mm长 靶组织2mm×2mm 其他组织340μm宽，110mm长 出口1mm×1mm 连接肝与Y连接的通道440μm宽 从Y连接到靶组织的通道100μm宽 人类生物芯片原型如前所述制造。器官区室的布置旨在模拟与已经口服的化合物(药物)的接触。当化合物口服时，它被从小肠或大肠吸收到血液中。由此通过肝门静脉直接循环到肝脏中，然后分布到全身(图27)。因此，对于这种设计，肝脏是第一器官区室，然后分流到其他组织区室和靶组织腔室。其他组织区室代表体内血液的分布和保留，靶组织区室代表目标治疗靶标(例如代表结肠肿瘤的结肠癌细胞)。结论 本发明提供了一种基于药代动力学的培养装置和系统，通常包括具有接收端和出口端的第一细胞培养腔室，和具有接收端和出口端的第二细胞培养腔室，和连接第一细胞培养腔室的出口端与第二细胞培养腔室的接收端的导管。优选地，该装置是基于芯片的，即，它在尺寸上是微型的。培养基可以通过第一细胞培养腔室、通过导管以及通过第二培养腔室循环。也可以在再循环环路中的一个或多个点给培养基充氧。
该装置可以包括从该装置的部分向芯片外的位置传送信号的机构，例如从该装置的部分向芯片外的位置传送信号的波导。可以存在多个波导，例如第一波导传送来自第一腔室的信号，第二波导传送来自第二腔室的信号，等等。
在一个实施方案中，第一细胞培养腔室和第二细胞培养腔室中的至少一个是三维的。在另一个实施方案中，第一细胞培养腔室和第二细胞培养腔室都是三维的。
用于保持存活状态的细胞的装置也包括流体循环机构，可以是流通型流体循环机构或再循环流体的流体循环机构。用于保持存活状态的细胞的装置也包括至少连接第一区室和第二区室的流体路径。在一个实施方案中，除泡剂除去流动路径中的气泡。该装置可进一步包括泵机构。泵机构可以位于基板上。
提供了一种改变基板大小以使至少两种存活状态的细胞类型保持在至少两个细胞腔室中的方法。该方法包括确定在基板上保持的细胞型的步骤，以及应用来自基于生理学的药代动力学模型的限制以确定基板的物理特性的步骤。应用来自基于生理学的药代动力学模型的限制的步骤包括确定将在基板上形成的腔室的类型，还可包括确定至少一个细胞腔室的几何形状，以及确定将两个细胞腔室互相连接的流动路径的几何形状。应用来自基于生理学的药代动力学模型的限制的步骤还可包括确定流动路径的流动基质组成。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，如同每个一单独的出版物或专利申请具体且分别地引入作为参考。
应当理解，上述描述的目的在于说明，而并非限制。本领域技术人员在阅读以上描述后将会明白许多其他实施方案。本发明的范围因此由附加的权利要求书以及这些权利要求所述的等同方案的全部范围来确定。
本发明的一个实施方案涉及微型通透性材料。本发明的某些实施方案描述了作为与微型装置结合的生物屏障的通透性材料，应当理解，微型通透性材料可以存在于多种环境和装置中。
合适的微型装置的一个例子包括一个或多个微型部件，这些部件的尺寸设置为在如下条件下保持生物材料在体外提供与体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值。关于微型部件的各种实施方案的形成和操作的细节在上面已经披露。下面为了说明，“微型”可以表示范围为大约0.1μm到大约500μm的尺寸。因此，微型部件的尺寸可以为其至少一个维度落入微型范围内。还应当理解，本申请公开的各种实施方案可以用大于上述微型水平的规模来实现。下面为了说明，“毫米规模”可以表示范围为大约0.1mm到大约100mm的尺寸。因此，本申请公开的一个或多个部件可以为毫米规模的部件，其中其至少一个维度落入毫米规模范围内。应当理解，某些部件可以具有一个为微型而另一个为毫米规模的尺寸组合。这些部件可以表征为两种规模中的任一种。而且，本申请公开内容的各种部件可以用上述范围之外的尺寸实现。例如，在一个实施方案中，微型部件可以具有小于0.1μm或大于500μm的尺寸。同样，在一个实施方案中，毫米规模的部件可以具有小于0.1mm或大于100mm的尺寸。
在其他实施方案中，微型通透性材料有利于不同流体系统之间的相互作用。例如，口服药物进入胃肠(GI)系统。一种或多种与药物有关的化合物可以通过小肠内层从GI系统通往循环系统的血液。血液中的药物化合物可以到达并影响各个器官和/或系统。例如，药物化合物可以从血液通往脑流体系统，由此影响大脑。
在一个实施例中，药物化合物可以从血液通往肝脏中的胆道系统，并且进入肠肝循环。药物化合物可以长时间保持在肠肝循环中，并且在肝脏中产生高浓度，因此可能意料之外地成为肝毒性的。
因此，人们可以理解，说明药物化合物或其代谢物在不同系统之间的通过可以更好地理解有关药物的药代动力学。
图31显示了在一个实施方案中，可以提供在第一和第二流体系统3102、3140之间的相互作用3100，并且在体外保持在生理参数值类似于体内发现的值的条件下。为了说明，第一流体系统3102包括一个或多个微型部件，第二流体系统3104也包括一个或多个微型部件。
如图31进一步所示，第一和第二流体系统3102、3140之间的相互作用3100可以涉及一种或多种化合物从第一系统3102向第二系统3104的通过(用3106箭头表示)，和/或一种或多种化合物从第二系统3104向第一系统3102的通过(用3108箭头表示)。
图32显示具有可以用微型部件构成的一些实例流体系统的实例生物系统3110的框图。血液循环系统3112、GI系统3114、胆道系统3116和脑流体系统3118是可以用微型部件模拟的一些非限制性实例。
在一个实施方案中，在基于微型部件的系统之间提供至少一个系统间相互作用。各种系统间相互作用在下面更详细地描述。
图33A-33D显示可以为两个或多个流体系统排列的各种相互作用结构的非限制性实例。在一个实施方案中，如图33A所示，双系统结构3120可以包括两个系统“A”和“B”(3162和3164)之间的相互作用3172。图33B显示在一个实施方案中，三系统结构3130可包括A和B(3162和3164)之间的相互作用3174，以及B和“C”(3164和3166)之间的相互作用3176。图33C显示在一个实施方案中，四系统结构3140除了类似于图33B的相互作用3174和3176的相互作用3178和3180之外，还可以包括B和“D”(3164和3168)之间的相互作用3182。
在一个实施方案中，与相互作用3178和3180有关的药代动力学(图33C)可能基本与相互作用3174和3176(图33B)相同。在另一个实施方案中，与相互作用3174和3176(图33B)相比，附加的相互作用3182(图33C)的存在可以显著改变与相互作用3178和3180有关的药代动力学。
图33D显示在一个实施方案3150中，多个系统(例如，三个)可以构造为提供并模拟再循环功能。在所示的实例中，系统A和B(3162和3164)显示通过相互作用3184相互作用；系统B和C(3164和3166)通过相互作用3186相互作用；系统C和A(3166和3162)通过相互作用3188相互作用。
图33A-33D所示结构的特定实例在下面更详细地描述。其他结构也是可能的。
图34A-34C显示了双流体系统结构3200的一个实施方案的各种视图。图34A显示图34B的装配图的局部分解图，图34C显示俯视图。第一系统显示包括限定了一个或多个区室(示为区室3222)的层3220。如图所示，可以经输入流动(用箭头3250表示)通过输入途径3212(通过盖层3210限定)和输入通道3260给区室3222提供流体，用于药代动力学研究。来自区室3222的流体可以通过输出通道3262和输出途径3214(通过盖层3210限定)作为输出流(用箭头3252表示)流出。
第二系统显示包括限定了一个或多个区室(示为区室3232、3234、3236)的层3230。如图所示，可以经输入流动(用箭头3254表示)通过输入途径3242(通过盖层3240限定)和与区室3232连接的输入通道3270给区室3232、3234和3236提供流体，用于药代动力学研究。来自区室3232的流体可以通过通道3272、3274和3278供应给其他区室3234和3236。来自区室3234和3236的流体可以通过输出通道3276和3280并通过输出途径3244(通过盖层3240限定)作为输出流(用箭头3256表示)流出。
在一个实施方案中，区室、输入和输出途径、和第一和第二系统的各个通道可以用以上公开的各种技术形成。两个流体系统的流体的循环可以用以上公开的各种技术实现。
如图34A-34C所示，双流体系统结构3200包括位于第一系统3220的至少一个区室和第二系统3230的至少一个区室之间的通透性材料3224。在所示实例中，通透性材料3224被显示为位于区室3222和3232之间，由此允许在第一和第二系统3220和3230之间的流体相互作用。通透性材料3224在下面更详细地描述。
在图34A-34C中，区室3222和3232和通透性材料3224显示为具有不同的尺寸。这只是为了清楚地说明。通透性材料3224的尺寸可以小于、大于或通常等于区室3222和3232中的一个或两个。在一个实施方案中，通透性材料3224可以部分或基本上位于这些区室任一个的内部，或区室3222和3232之间。
图34D显示图34A所示实例结构的变化的一个实施方案3200的局部分解图。如图所示，双流体系统结构3200可以包括第一模块3902，第一模块3902具有包括一个或多个细胞培养区室(示为区室3914)和/或一个或多个生物屏障(示为屏障3916)的第一培养系统。
如图所示，双流体系统结构3200可以包括第二模块3904，第二模块3904具有包括一个或多个细胞培养区室(示为区室3918和3920)的第二培养系统。在一个实施方案中，第二模块3904也可以包括一个或多个生物屏障(未示出)。
在一个实施方案中，如图所示，双流体系统结构3200可以包括促进第一培养系统3902的流体流动的流体相互连接3910。在一个实施方案中，外壳顶部3900可以位于第一模块3902之上，并且限定流体相互连接3910的流体途径。
类似地，流体相互连接3922促进第二培养系统3904的流体流动。在一个实施方案中，外壳底部3906可以位于第二模块3904之下并且限定流体相互连接3922的流体途径。
本文为了说明，“通透性”材料包括允许一种或多种材料以在生物系统中发现的或模拟生物系统的选择性方式通过的任何生物或非生物材料。因此，本文使用的通透性材料可以包括半透性材料。
上述双系统结构3200可以为药代动力学研究提供组合的体外环境，例如，但不限于GI-血液、血液-胆汁、血液-脑、血液-组织、和血液-尿。
图35A和35B显示了三流体系统结构3290的一个实施方案的局部分解图和装配图。第一系统显示包括限定了一个或多个区室(示为区室3304)的层3300。第二系统显示包括限定了一个或多个区室(示为区室3322、3324和3328)的层3320。第三系统显示包括限定了一个或多个区室(示为区室3342)的层3340。
在一个实施方案中，可以通过途径3302a和3302b给第一系统3300供应流体(箭头3350和3352)。也可以通过途径3344a和3344b给第三系统3340供应流体(箭头3354和3356)。第二系统3320可以具有提供第一和第二系统3300和3340之间的连接的循环。与第一系统3300相互作用的区室3322可以通过通道(未示出)和途径3326a和3326b与区室3328相互连接，区室3328与第三系统3340相互作用。
如图35A和35B所示，三流体系统结构3290包括两个通透性材料装配体3310和3330。第一通透性材料装配体3310显示构造为使得通透性材料3312位于第一和第二系统3300和3320的区室3304和3322之间。第二通透性材料装配体3330显示构造为使得通透性材料3332位于第二和第三系统3320和3340的区室3328和3342之间。
在图35A和35B所示的实例结构3290中，通透性材料3312和3332显示为分开的层3310和3330的部分。在一个实施方案中，通透性材料3312和3332可以形成为它们的一个相邻层的一部分。例如，通透性材料3312可以形成为层3300和3320中任一个的一部分，使得通透性材料3312将区室3304和3322分开。类似地，通透性材料3322可以形成为层3320和3340中任一个的一部分，使得通透性材料3322将区室3328和3342分开。
在一个实施方案中，通透性材料3312和3322可以构造为促进它们各自的系统间相互作用。通透性材料3312和3322在下面更详细地描述。
在一个实施方案中，三系统结构可以按照以上关于图35A和35B所述的方式实施。图36显示这种三流体系统的实例3360的框图。药物递送系统3362可以代表第一系统3300(图35A和35B)；器官系统3364可以代表第二系统3320；脑3366可以代表第三系统3340。药物递送系统3362和器官系统3364之间的相互作用3370可以代表通透性材料装配体3310；器官系统3364和脑3366之间的相互作用3372可以代表通透性材料装配体3330。
在三系统结构的应用实例3360中，药物递送系统3362可以包括GI系统，器官系统可以包括各种器官(除脑以外)和血液循环系统。因此，相互作用3372可以包括与药物有关的一种或多种化合物从GI系统向血液中转移；相互作用3372可以包括与药物有关的一种或多种化合物从血液向脑的流体系统转移。
应当理解，其他三系统结构也是可能的。
图37显示涉及肝3384的实例结构3380的框图。肝3384显示通过肠肝循环(显示为箭头3390和3392)与GI道3382相互作用。肝3384也显示与泌尿系统3388(显示为箭头3396)和组织3386(显示为箭头3394)相互作用。介于中间的血液循环系统可以促进肝3384和泌尿系统3388之间的相互作用3396。类似地，血液循环系统可以促进肝3384和组织3386之间的相互作用3394。
图38显示血液循环系统3406也可以促进与肝3384和GI道3382有关的肠肝循环过程。如图所示，(肝3384的)胆道系统3402与GI系统3404相互作用(箭头3410)，GI系统3404又与循环系统3406相互作用(箭头3412)。循环系统3406与胆道系统3402相互作用(箭头3414)，由此形成再循环过程。
如通常所知的，肝脏产生胆汁酸，胆汁酸递送给小肠帮助消化。在消化道中，胆汁酸被转化为结合的胆汁盐(原发的或继发的)，这些盐被主动或被动地吸收到肝门循环中，被肝脏再循环。每个胆汁盐分子在肠肝循环中一般再利用大约20次。
上述再循环过程的一个后果是药物或其成分可以在肠肝循环中保留延长的一段时间。因此，一些没有毒性的分子可能在肝脏中积累，并且成为毒性的。因此，与肠肝循环过程有关的药代动力学可以提供对测试药物的毒性(或非毒性)的重要理解。
如上所述，一种或多种类型的通透性材料可以促进上述不同流体系统之间的相互作用的各种特征。在一些实施方案中，这些通透性材料可以是微型透性装置的一部分。
如以下更详细描述的，本申请公开内容的一个或多个特征可以单独地或以组合形式提供各种系统和方法。例如，一种装置可以具有至少一个部件和通透性材料，该部件的尺寸设置为将生物材料保持在一定的条件下，该条件在体外提供与体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值。通透性材料在下面更详细地描述。在一个实施方案中，至少一个部件包括微型部件。
在一个实施方案中，至少一个部件可以构造为至少代表一个或多个以下的非限定性实例系统中枢神经、循环、消化、胆道、肺、泌尿、眼、嗅觉、上皮和淋巴系统。
在一个实施方案中，如本文所述，所述装置可进一步包括至少一个与通透性材料连接的微流通道。这种通道可以促进流体在通透性材料之中、穿过通透性材料、或在其附近的流动，以提供至少一个药代动力学参数。在一个实施方案中，这种流体流动的特性基于一种数学模型，如基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
在一个实施方案中，至少一个部件和/或通透性材料可以集成为芯片格式。
在一个实施方案中，通透性材料可以位于所述装置之中或其外部。在一个实施方案中，通透性材料可以包括至少部分涂覆有机材料的微孔材料。
在一个实施方案中，细胞可以位于通透性材料之中、之上或靠近其两侧。在一个实施方案中，具有这种细胞的装置可以促进诸如吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平等参数的确定或评估。在一个实施方案中，位于通透性材料任一侧上的细胞可以是相同的类型或不同的类型。
图39显示微型通透性装置3420的一个实施方案，其具有促进两个流体系统之间的一个或多个相互作用的通透性材料3430。通透性材料3430的一些非限制性实例可以包括以下物质膜、多孔膜、多孔硅、微孔硅、半透膜、微孔聚合物、多孔聚碳酸酯膜、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片。
在一个实施方案中，通透性材料3430可以在通透性材料3430的微孔表面之中、之上或附近包含有机或无机材料。
在一个实施方案中，通透性材料3430包括微孔材料。微孔材料的一些非限制性实例可以包括以下物质在微孔材料的微孔表面之中、之上或附近培养、沉积或插入的有机或无机材料。
在一个实施方案中，通透性材料3430可以构造为模拟生物屏障、物质通过或穿过生物屏障、或者物质在生物屏障中、通过生物屏障或被生物屏障吸收的至少一种。在一个实施方案中，生物屏障可以包括以下至少一种胃肠屏障、血脑屏障、肺屏障、胎盘屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅觉屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空气-组织屏障、血-胆汁屏障、口屏障、肛门直肠屏障、阴道屏障和尿道屏障。
在一个实施方案中，通透性材料3430可以促进各种药代动力学参数的确定，而说明一个或多个系统间相互作用。这些药代动力学参数可以包括下列至少一个组织大小、组织大小比、组织∶血液体积比、药物停留时间、细胞间相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、细胞的代谢、剪应力、流速、几何形状、循环通过时间、液体分布、组织和/或器官间相互作用和细胞的分子转运。
在一个实施方案中，通透性材料3430可以促进物质在通透性材料中、通过通透性材料或被通透性材料的吸收、代谢或分布。
在一个实施方案中，通透性材料3430可以形成于、包含于、插入、装配、制造或构建于一个装置中，该装置包括代表两个或多个流体系统的多个微型部件。
在一个实施方案中，通透性材料3430的任一侧或两侧可以构造为允许细胞或细胞材料培养、附着或定位。这种构造可以允许确定诸如吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平等参数。
在一个实施方案中，通透性材料3430可以包括能够形成汇合单层并极化的细胞系。
在一个实施方案中，通透性装配体3430可以包括微型通透性材料3432。在一个实施方案中，微型通透性材料3432可以包括具有多个孔的微孔基板。在一些实施方案中，孔通常具有小于大约10μm的尺寸。在一些实施方案中，微孔基板阻止尺寸大于大约10μm的颗粒通过。
在一个实施方案中，微孔基板可以由具有尺寸为大约0.1至10μm的孔的多孔硅形成。这种基板的厚度“T”的范围可以为大约5至100μm。在一个实施方案中，微孔基板可以由具有尺寸为大约0.4μm的孔的多孔聚碳酸酯膜形成。这种基板的厚度“T”可以为大约100μm。在一个实施方案中，微孔基板可以由具有尺寸为大约0.2至1μm的孔的多孔低应力氮化硅材料形成。这种基板的厚度“T”的范围可以为大约2-5μm。
在一个实施方案中，侧向尺寸“L”(与确定厚度的方向垂直)可以具有相对于区室438的侧向尺寸的任何值。对于给定的厚度，较大的表面积(因此较大的侧向尺寸)可能提供较大量的两个流体系统之间的相互作用。因此，两个系统之间材料的通过量可以通过提供不同侧向大小的表面积来控制。因此，侧向尺寸L可以小于、基本上等于(如图39的实例所示)或者大于区室3438的相应的侧向尺寸。
在一个实施方案中，微孔基板具有范围为大约0.1至10mm的侧向尺寸。在实施方案中，侧向尺寸大约为3.4mm×4mm。
如图39进一步所示，通透性装配体3430可以进一步包括一种或多种位于微型通透性材料3432之上、之内和/或附近的功能特异性细胞3434。下面以血液和胆道系统之间的相互作用为例更详细地描述功能特异性细胞3434。然而应当理解，不同的功能特异性细胞可以相对于微型通透性材料3432定位，以对不同的系统间相互作用提供所需的功能。
在一个实施方案中，通透性装配体3430可以进一步包括一种或多种促进细胞3434结合到微型通透性材料3432表面上的粘合剂3445。粘合剂3445的例子在下面更详细地描述。
在一个实施方案中，通透性装配体3430可以进一步包括一个或多个提供类似于成纤维细胞的功能的部件3436。在一个实施方案中，功能特异性细胞3434可以分布在微型通透性材料3432的表面上，并且成纤维细胞3436可以填充微型通透性材料3432表面上未被细胞3434占据的区域。在这种结构中，成纤维细胞可以提供密封功能，使得材料通过通透性装配体3430主要经由细胞3434发生。
在一个实施方案中，成纤维细胞3436可以提供有利于生长和维持细胞3434的环境。在一个实施方案中，成纤维细胞3436可以提供两种功能—细胞生长和维持，以及通透性材料3430的密封。
在一个实施方案中，通透性装配体3430可以形成为层3422的一部分，以在通透性装配体3430的至少一例上限定区室3438。在其他实施方案中，通透性装配体3430的两侧可以限定各自的区室。对于这种结构，通透性装配体3430可以在通透性装配体3430的任一侧或两侧上具有细胞3434和粘合剂3434。
图40A和40B显示各种实例情形，其中可以提供通透性装配体以允许不同流体系统之间的相互作用。实例系统间的相互作用基于肠肝循环过程。然而，其他系统间相互作用可以以类似的方式促进。
图40A显示血流系统和胆汁流系统之间的相互作用结构3440的一个实施方案。在一个实施方案中，通透性装配体3442可以介于血流和胆汁流之间，并且可以包括微型通透性材料3444。在一些实施方案中，微型通透性材料3444可以以与以上关于图39所述类似的方式形成并且设置尺寸。
在一个实施方案中，通透性装配体3442可以进一步包括一种或多种功能特异性细胞3446。对于血液-胆汁相互作用，细胞3446可以包括肝细胞。
肝脏的肝细胞可以是极化的细胞；分化的肝细胞的不同表面可以具有独特的功能。在一个实施方案中，肝脏中底外侧表面的窦状膜和顶表面的胆小管膜可以用以下方式模拟。分离的肝细胞通常不被极化。当物理接触相邻的肝细胞时，肝细胞通常成为极化的。胆小管可以在两个或多个这样并列的细胞之间形成。
外部信号对于上皮细胞极化可能是重要的，两个相邻肝细胞之间的物理接触看来是这种肝细胞极化的信号。肝细胞可以与相邻的肝细胞通过连接或粘附蛋白质的结合形成连接，这些蛋白质的相互作用看来是胆小管形态发生的重要的信号。
如图40A所示，这些蛋白质可以作为粘合剂3445促进肝细胞3446与微型基板3444的结合和肝细胞的极化。在一些实施方案中，这些蛋白质可以包括缝隙连接蛋白质(例如联接蛋白32)、紧密连接蛋白质(例如闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2)、粘着连接蛋白质(例如E-钙粘蛋白和β-联蛋白)、和细胞粘附分子(例如桑椹粘着蛋白)。
在一个实施方案中，附着到微型通透性基板3444上的一种或多种这样的蛋白质可以有效地模拟相邻肝细胞的血浆膜表面。当分离的肝细胞与该表面结合时，肝细胞可以被诱导极化，使得顶表面或胆小管(3449b)可以在微型通透性基板3444的表面上形成，底外侧或窦状表面(3449a)可以在相对的表面上形成。
在一个实施方案中，肝细胞3446可以以适当的密度接种，以抑制细胞-细胞相互作用。一旦肝细胞3446附着到微型通透性基板3444上，就可以在表面上培养成纤维细胞3448或其他合适的细胞，以基本上密封微型通透性表面未被肝细胞3446占据的区域，由此形成“血液-胆汁”屏障，和/或提供有利于肝细胞生长的环境。
在一个实施方案中，可以导入选择的一种或多种目标化合物，以在肝细胞3446上流过。这种化合物可以通过肝细胞3446穿过微型通透性表面转运进入装置3440的胆汁替代物流。可以测定胆汁替代物流中该化合物或其代谢物的存在，以确定胆汁分泌。
一旦将胆汁转移到GI系统中并且重吸收到血液系统中，GI系统中的“胆汁”可以包括以下化合物胆汁盐类(鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、胆酸、α-鼠胆酸和β-鼠胆酸)；磷脂类(磷脂酰胆碱(大约82％)、痕量的磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂)；胆汁醇类(5β-胆固醇-3α，7α，12α，26-四醇)；和氨基酸。
在一个实施方案中，胆汁流可以与GI流连接，以进一步模拟肠肝循环。在一个实施方案中，胆汁可以与GI液混合。这些混合可以(例如)以下面更详细描述的方式实现。
在如图40B所示的一个实施方案3460中，GI流可以与血流连接，以进一步模拟肠肝循环。相互作用3460可以包括通透性装配体3462，通透性装配体3462具有微型通透性基板3464以及由一个或多个功能特异性细胞3466限定的表面。在一个实施方案中，功能特异性细胞3466可以包括肠上皮细胞。在一个实施方案中，Caco-2细胞3468可以设置在细胞3466附近，以促进化合物从GI流向血流的体内吸收。
在一个实施方案中，通透性材料3462可以包括在微型通透性基板3464上培养的胃肠肠细胞层。在一个实施方案中，胃肠肠细胞层的至少一部分可以位于装置3460中，使得流体可以沿该层的任一侧流动而不通过该层。在一个实施方案中，位于胃肠肠细胞层的第一侧南上的至少第一微型部件可以代表胃肠道，位于该单层的第二侧上的至少第二微型部件可以代表循环系统。在一个实施方案中，可以提供第三微型部件并且构造为含有相同或不同类型的生物材料。
图41A和41B显示装置3700的实例实施方案的局部分解图和装配图，其可以提供对以上所述肠肝再循环过程的药代动力学模拟。装置3700可以包括GI替代模块3720，GI替代模块3720可以提供与以上图40B所述类似的GI-血液相互作用功能。装置3700还可以包括器官系统模块3730，器官系统模块3730可以提供与以上图40A所示类似的血液-胆汁相互作用功能。机罩3710和3760可以为装置3700提供外壳，并且也可以为各种液流提供途径。
如图所示，流入(箭头3770)和流出(箭头3772)GI替代模块3720的G I流可以由相应的途径3712和3714提供。类似地，流入(箭头3774)和流出(箭头3776)器官系统模块3730的血液侧的血流可以由相应的途径3762、3750和3752、3768提供。类似地，流入(箭头3778)和流出(箭头3780)器官系统模块3730的胆汁侧的胆汁流可以由相应的途径3764和3766提供。
如图所示，GI替代模块3720可以包括区室3722，区室3722包括具有微型通透性基底3724的通透性装配体。微型通透性基底3724可以由以上对于图39所述的任意一种或组合的材料形成。通透性装配体也可以包括在微型通透性基底3724上形成的肠上皮细胞3726。在一个实施方案中，区室3722的GI侧可以包括与细胞3726相邻的Caco-2细胞3728。如通常所知，Caco-2细胞可以促进化合物从肠到血液的体外吸收。
通过GI替代模块3720的通透性装配体吸收的化合物可以在器官系统模块3730的区室3732处进入血液系统。血液可以在区室3732和一个或多个其他区室之间循环。为了说明，显示了具有用于血液-胆汁相互作用的通透性装配体的区室3734和模拟靶器官的区室3744(通过靶细胞3746)。在一个实施方案中，靶器官3744可以包括可被药物活性影响的器官或组织。例如，当检测心脏药物时，靶器官3744可以是心脏。在另一实施例中，当检测药物毒性时，靶器官可以是胰。
区室3734的通透性装配体显示包括微型通透性基底3736。微型通透性基底3736可以由以上关于图39所述的任意一种或组合的材料形成。通透性装配体也可以包括在微型通透性基底3736上形成的肝细胞3738。在一个实施方案中，肝细胞3738可以通过粘合剂以上述图40A的方式结合到微型通透性基底3736上。在一个实施方案中，通透性装配体可以进一步包括成纤维细胞3740，以提供以上关于图40A所述的功能性。
器官系统模块3730的通透性装配体可以促进血流(在区室3734的空间3742中)与胆汁流(在通透性装配体的另一侧)之间的血液-胆汁相互作用。胆汁流然后可以通过途径3764和3766循环，胆汁可以再引入(未示出)GI流中。
图41C显示了与图41A所示相似的器官系统模块3730的局部分解图。在图41C中，通过局部放大更详细地显示了具有用于血液-胆汁相互作用的通透性装配体的区室3734。在一个实施方案中，区室3734的通透性装配体可能类似于以上关于图39所述。因此，通透性装配体3430可以包括通透性材料3432和在通透性材料3432的任一侧或两侧上形成的细胞或细胞材料3434。在一个实施方案中，细胞3434可以是如本文所述结合的肝细胞。在一个使用肝细胞的实施方案中，通透性装配体3430可以进一步包括成纤维细胞3436。
图42显示了可以在图41A和41B的实例肠肝再循环装置中实现的不同液流的示意性实例3800。在一个实施方案中，可以提供GI液流3802(以虚线显示)以流经具有如本文所述的胃肠-血液屏障3812的胃肠道区室3810。GI液流3802可以从GI液存储器3850流向另一个存储器(未示出)。在一个实施方案中，GI液流3802不再循环。
如图42所示，GI-血液屏障3812可以促进GI-胆汁相互作用。血流3804以实线表示。标示为3804a的血流与胃肠道区室3810中的GI流3802通过屏障3812相互作用，并且导向肝区室3820。血液-胆汁屏障3822(如本文所述)可以促进血流3804a与胆汁流3806的相互作用。在一个实施方案中，流向肝区室3820的胆汁流3806可以从胆汁流体存储器3860中提供。在一个实施方案中，来自肝区室3820的胆汁流3806可以与GI流3802在胃肠道区室3810上游的位置处混合，由此提供来自肝区室3820的胆汁的再循环功能。
在一个实施方案中，来自肝区室3820的血流3804a可以被引导到一个或多个其他区室中。例如，血流3804c(通过3804b)显示将血液提供给靶组织区室3830，血流3804e(通过3804b)显示给其他组织区室3840提供血液。来自区室3830和3840的血流3804d和3804f可以在胃肠道区室3810上游的位置处重新混合为血流3804g，它可以成为血流3804a的一部分。
图43A至43E显示了上述微型通透性装置的一个实施方案的各个制造阶段。图44显示了可以制造图43A至43E的装置的方法3520的一个实施方案。
如图43A所示，可以在基板3500上形成开口3502。开口的形成可以在程序块3522中实现。
如图43B所示，微型通透性基板3504可以在开口3502中形成。微型通透性基板3504的形成可以在程序块3524中实现。
如图43C所示，可以将一种或多种粘合剂3506设置在微型通透性基板3504上。粘合剂3506的提供可以在程序块3526中实现。
如图43D所示，一种或多种功能特异性细胞3508可以与微型通透性基板3504通过粘合剂3506结合。功能特异性细胞3508的这种结合可以在程序块3528中实现。
如图43E所示，可以在功能特异性细胞3508之间引入一种或多种成纤维细胞3510，以提供密封和/或促进细胞3508的生长和维持。成纤维细胞3510的这种引入可以在程序块3530中实现。
在一个实施方案中，微型通透性基板3504可以通过以下非限制性实施例来形成。在施加偏性的条件下通过用HF(氢氟酸)蚀刻由硅形成微孔表面。也可以应用用于直径大于大约0.4微米的孔径的标准光刻法和蚀刻技术，或者应用用于直径小于大约0.4微米的孔径的电子束光刻法和蚀刻法，由低应力氮化硅薄膜形成微孔表面。
在一个非限制性实施方案中，可以应用微接触印刷技术将粘合蛋白质在微孔表面上形成显微图案。硅氧烷弹性体“橡皮图章”可以用复制模塑技术产生。橡皮图章可以浸没在粘合蛋白质的溶液中，这些粘合蛋白质然后可以沉积在微孔材料的表面上，由此产生粘合剂蛋白质的显微图案。该方法通常被称为微接触印刷。
在一个非限制性实施方案中，可以使肝细胞连接到粘合蛋白质上，一旦连接，就可以将成纤维细胞就导入表面内，并且允许附着到微孔表面上未被肝细胞占据的基本上所有区域。
也可以采用其他制造技术。
在一个实施方案中，微型通透性材料(如图39中的3432)和至少一种粘合剂(如图43C中的3506)可以确定一种装置。至少一种粘合剂可以设置为极化一种物质，该物质表现出肝功能的至少一个特性。
在一个实施方案中，所述物质可以是一种或多种肝细胞。在一个实施方案中，所述物质可以是遗传工程生物材料。
在一个实施方案中，粘合剂可以将肝细胞结合并极化到微型通透性材料上。
在一个实施方案中，装置可以包括微型通透性材料(如图39中的3432)和至少一种表现出肝功能的至少一个特性的物质，其中该物质处理的分子可以被引导通过微型通透性材料的至少一部分。
图45显示了可以使用本公开内容的一种或多种技术连接的系统的各个组合的非限制性实例。微型通透性装置3540允许血液和胆汁系统之间的相互作用。微型通透性装置3542允许血液和胃肠系统之间的相互作用。选择的连接(以箭头3544显示)允许胆汁和胃肠系统之间的相互作用(例如，通过在选定的位置混合)。微型通透性装置3546允许血液和脑系统之间的相互作用。微型通透性装置3548允许血液和泌尿系统之间的相互作用。
应当理解，通过微型通透性装置，其他系统间相互作用是可能的。因此通常，如图46所示，微型通透性装置3550允许第一流体系统和第二流体系统之间的相互作用。
在上述描述中，微型通透性装置的各种实施方案被描述为层的一部分，而该层是系统层或是分开的层的一部分。对于这种结构，与不同系统有关的区室被描述为是在不同层上形成的。
在一些实施方案中，这不一定是必需的。例如，在一个实施方案中，可以在层的一侧上形成器官系统模块(图41A和41B中的3730)，并且可以在同一层的另一侧上形成胃肠替代模块(图41A和41B中的3720)。
在另一个实例实施方案中，微型通透性装置可以在给定的层上形成，以限定两个区室，每个区室代表单独的系统。因此，如图47的实例实施方案3560所示，微型通透性装置3562可以在层上形成，以限定并且分隔两个区室3564和3566。因此，第一区室3564可以代表第一流体系统，第二区室3566可以代表第二流体系统。微型通透性装置3562可以提供第一和第二流体系统之间的相互作用。因此可以形成更复杂的系统，如图41A和41B所示。
尽管以上公开的实施方案已经展示、描述、指出了应用于以上公开的实施方案的本发明的基本新特征，但是应当理解，本领域技术人员在不背离本发明范围的情况下可以进行所示装置、系统和/或方法的细节形式的各种省略、替代和改变。因此，本发明的范围不应限于上述描述，而应由附加的权利要求书来限定。
权利要求
1.一种装置，包括
至少一个微型部件，该部件的尺寸设置为在如下条件下保持生物材料在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值；和
通透性材料。
2.权利要求1的装置，其中所述通透性材料选自膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一种。
3.权利要求1的装置，其中所述通透性材料进一步在微孔表面之中、之上或附近包括有机或无机材料。
4.权利要求1的装置，其中所述通透性材料构造为模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中的通过或穿过，或者物质在生物屏障中的、通过生物屏障的或被生物屏障的吸收。
5.权利要求4的装置，其中所述生物屏障选自以下至少一种胃肠屏障、血脑屏障、肺屏障、胎盘屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅觉屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空气-组织屏障、血-胆汁屏障、口屏障、肛门直肠屏障、阴道屏障和尿道屏障。
6.权利要求1的装置，其中至少一个药代动力学参数选自下列至少一个组织大小、组织大小比、组织∶血液体积比、药物停留时间、细胞间相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、细胞的代谢、剪应力、流速、几何形状、循环通过时间、液体分布、组织和/或器官间相互作用和细胞的分子转运。
7.权利要求1的装置，其中该装置测定物质在通透性材料中的、通过通透性材料的或被通透性材料的吸收、代谢或分布。
8.权利要求1的装置，其中所述部件构造为代表下列至少一个中枢神经系统、循环系统、消化系统、胆道系统、肺系统、泌尿系统、眼系统、嗅觉系统、表皮系统和淋巴系统的至少一部分。
9.权利要求1的装置，其中所述通透性材料位于该装置的内部或外部。
10.权利要求1的装置，其进一步包括至少一个与所述通透性材料连接的微流通道。
11.权利要求1的装置，其中流体在通透性材料中的、通过通透性材料的或靠近通透性材料的流动提供了所述至少一个药代动力学参数。
12.权利要求11的装置，其中流体通过该装置流动的特性基于一种数学模型。
13.权利要求12的装置，其中所述数学模型是基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
14.权利要求1的装置，其中所述部件或通透性材料集成为芯片格式。
15.权利要求1的装置，其中所述通透性材料包括在微孔材料上培养的胃肠肠细胞层。
16.权利要求15的装置，其中所述胃肠肠细胞层的至少一部分位于所述装置中，使得流体可以沿该层的任一侧流动，但是不通过该层。
17.权利要求16的装置，其中位于胃肠肠细胞层的第一侧面上的至少第一微型部件代表胃肠道，位于该单层的第二侧面的至少第二微型部件代表循环系统。
18.权利要求17的装置，进一步包括构造为含有相同或不同类型的生物材料的第三微型部件。
19.权利要求1的装置，其中所述通透性材料包括至少部分包覆有机材料的微孔材料。
20.权利要求1的装置，进一步包括位于通透性材料之中、之上或靠近其两侧的细胞。
21.权利要求20的装置，其中该装置提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。
22.权利要求20的装置，其中位于通透性材料任一侧上的细胞为相同的类型或不同的类型。
23.权利要求1的装置，进一步在通透性材料的微孔表面之中、之上或附近包含肝细胞。
24.权利要求23的装置，其中所述微孔表面的至少一部分包含使肝细胞极化的蛋白质。
25.权利要求1的装置，其中所述通透性材料包含能够形成汇合单层的细胞系。
26.权利要求1的装置，进一步包含将肝细胞与通透性材料结合的粘合剂。
27.权利要求26的装置，其中所述粘合剂使肝细胞极化。
28.权利要求26的装置，其中所述粘合剂包括选自下组的至少一种蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
29.权利要求1的装置，进一步在通透性材料之中、之上或附近包括第二种类型的生物材料。
30.权利要求1的装置，进一步在通透性材料之中、之上或附近包括成纤维细胞。
31.权利要求1的装置，进一步包括靠近通透性材料的第一侧面的血液替代物流动。
32.权利要求31的装置，进一步包括靠近通透性材料的第二侧面的胆汁替代物流动。
33.一种方法，包括
在如下条件下保持生物材料在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值；和
使物质通过通透性材料的至少一部分。
34.权利要求33的方法，进一步包括将生物材料保持在微型部件之内或附近。
35.权利要求33的方法，其中所述通透性材料选自膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一种。
36.权利要求33的方法，其中所述通透性材料进一步在微孔表面之中、之上或附近包含有机或无机材料。
37.权利要求33的方法，其中所述通透性材料构造为模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中的通过或穿过，或者物质在生物屏障中的、通过生物屏障的或被生物屏障的吸收。
38.权利要求37的方法，其中所述生物屏障选自以下至少一种胃肠屏障、血脑屏障、血-胆汁屏障、肺屏障、胎盘屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅觉屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空气-组织屏障、口屏障、肛门直肠屏障、阴道屏障和尿道屏障。
39.权利要求33的方法，其中至少一个药代动力学参数选自下列至少一个组织大小、组织大小比、组织∶血液体积比、药物停留时间、细胞间相互作用、液体停留时间、液体∶细胞比、细胞的代谢、剪应力、流速、几何形状、循环通过时间、液体分布、组织和/或器官间相互作用和细胞的分子转运。
40.权利要求33的方法，进一步包括测定物质在通透性材料中的、通过通透性材料的或被通透性材料的吸收、代谢或分布。
41.权利要求34的方法，其中所述部件构造为代表下列至少一个中枢神经系统、循环系统、消化系统、胆道系统、肺系统、泌尿系统、眼系统、嗅觉系统、表皮系统和淋巴系统的至少一部分。
42.权利要求33的方法，进一步包括将通透性材料定位于微型装置的内部或外部。
43.权利要求33的方法，其进一步包括使流体通过至少一个与通透性材料连接的微流通道流动。
44.权利要求33的方法，其中流体在通透性材料中的、通过通透性材料的或靠近通透性材料的流动提供了至少一个药代动力学参数。
45.权利要求44的方法，其中流体通过该装置流动的特性基于一种数学模型。
46.权利要求45的方法，其中所述数学模型是基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
47.权利要求33的方法，进一步包括将微型部件或通透性材料集成为芯片格式。
48.权利要求33的方法，其中所述通透性材料包括在多孔材料上培养的胃肠肠细胞层。
49.权利要求48的方法，进一步包括定位胃肠肠细胞层的至少一部分，使得流体可以沿该层的任一侧流动，但是不通过该层。
50.权利要求49的方法，其中位于胃肠肠细胞层的第一侧面上的至少第一微型部件代表胃肠道，位于该单层的第二侧面上的至少第二微型部件代表循环系统。
51.权利要求50的方法，进一步包括构造为含有相同或不同类型的生物材料的第三微型部件。
52.权利要求33的方法，其中所述通透性材料包括至少部分包覆有机材料的微孔材料。
53.权利要求33的方法，进一步包括将细胞定位于通透性材料之中、之上或靠近其两侧。
54.权利要求53的方法，进一步包括提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。
55.权利要求53的方法，其中位于通透性材料任一侧上的细胞为相同的类型或不同的类型。
56.权利要求33的方法，进一步包括将肝细胞定位于通透性材料的微孔表面之中、之上或附近。
57.权利要求56的方法，其中所述微孔表面的至少一部分包含使肝细胞极化的蛋白质。
58.权利要求53的方法，其中所述通透性材料包含能够形成汇合单层并极化的细胞系。
59.权利要求33的方法，进一步包括将肝细胞结合在通透性材料上。
60.权利要求59的方法，进一步包括使肝细胞极化。
61.权利要求59的方法，其中所述结合包括使用粘合剂，该粘合剂是选自下组的至少一种蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
62.权利要求33的方法，进一步包括将将第二种类型的生物材料定位在通透性材料之中、之上或附近。
63.权利要求33的方法，进一步包括将成纤维细胞定位在通透性材料之中、之上或附近。
64.权利要求33的方法，进一步包括使血液替代物靠近通透性材料的第一侧面流动。
65.权利要求64的方法，进一步包括使胆汁替代物靠近通透性材料的第二侧面流动。
66.一种形成装置的方法，包括
形成一个部件，该部件构造为在如下条件下保持生物材料在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值；和
添加、形成或提供通透性材料，其中该通透性材料构造为使物质通过该通透性材料的至少一部分。
67.一种装置，包括
在如下条件下保持生物材料的装置在体外提供与在体内发现的至少一个药代动力学参数值相当的至少一个药代动力学参数值；和
提供通透性屏障的装置。
68.一种装置，包括
微型通透性材料；和
至少一种构造为将物质极化的粘合剂，其中该物质表现出肝功能的至少一个特性。
69.权利要求68的装置，其中所述物质是一种或多种肝细胞。
70.权利要求68的装置，其中所述物质是遗传工程生物材料。
71.权利要求68的装置，其中所述粘合剂将肝细胞结合并且极化到微型通透性材料上。
72.权利要求68的装置，进一步包括第二种物质类型。
73.权利要求1的装置，进一步包含位于微型通透性材料的至少一个表面附近的一种或多种成纤维细胞。
74.权利要求68的装置，其中所述微型通透性材料选自有机材料、无机材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一种。
75.权利要求68的装置，其中所述微型通透性材料位于微孔表面之中、之上或附近。
76.权利要求68的装置，其中所述微型通透性材料构造为模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中的通过或穿过，或者物质在生物屏障中的、通过生物屏障的或被生物屏障的吸收。
77.权利要求68的装置，其中所述装置由微型通透性材料或通过微型通透性材料处理物质。
78.权利要求77的装置，其中所述处理进一步包括以下至少一种分子的吸收、提取、排泄、代谢和分配。
79.权利要求68的装置，其中所述微型通透性材料位于所述装置的内部或外部。
80.权利要求68的装置，进一步包括至少一个与微型通透性材料连接的微流通道。
81.权利要求68的装置，其中流体通过所述装置流动的特性基于一种数学模型。
82.权利要求81的装置，其中所述数学模型是一种基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
83.权利要求68的装置，其中所述部件或微型通透性材料集成为芯片格式。
84.权利要求68的装置，其中所述装置提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。
85.权利要求68的装置，进一步包括位于微型通透性材料之中、之上或靠近其两侧的生物材料。
86.权利要求85的装置，其中位于微型通透性材料任一侧上的生物材料为相同的类型或不同的类型。
87.权利要求68的装置，其中微型通透性材料包含能够形成汇合单层的细胞系。
88.权利要求68的装置，其中所述粘合剂包括选自下组的至少一种蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
89.权利要求68的装置，进一步包括靠近微型通透性材料的第一侧面的血液替代物流动。
90.权利要求89的装置，进一步包括靠近微型通透性材料的第二侧面的胆汁替代物流动。
91.一种方法，包括将表现出肝功能的至少一个特性的物质以使该物质极化的方式结合到微型通透性材料上。
92.权利要求91的方法，其中所述物质是一种或多种肝细胞。
93.权利要求91的方法，其中所述物质是遗传工程生物材料。
94.权利要求91的方法，进一步包括提供第二种物质类型。
95.权利要求91的方法，进一步包括将一种或多种成纤维细胞定位于微型通透性材料的至少一个表面附近。
96.权利要求91的方法，其中所述微型通透性材料选自有机材料、无机材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸盐、胶原、MATRIGEL、细胞、细胞材料、组织和组织片中的至少一种。
97.权利要求91的方法，进一步包括将微型通透性材料定位于微孔表面之中、之上或附近。
98.权利要求91的方法，其中所述微型通透性材料模拟以下至少一种生物屏障，物质在生物屏障中的通过或穿过，或者物质在生物屏障中的、通过生物屏障的或被生物屏障的吸收。
99.权利要求91的方法，进一步包括在微型通透性材料中、通过微型通透性材料或由微型通透性材料处理物质。
100.权利要求99的方法，其中所述处理进一步包括以下至少一种分子的吸收、提取、排泄、代谢和分配。
101.权利要求91的方法，进一步包括将微型通透性材料定位于装置的内部或外部。
102.权利要求91的方法，进一步包括提供至少一个与微型通透性材料连接的微流通道。
103.权利要求91的方法，其中与肝功能的至少一个特性有关的流体流动的特性基于一种数学模型。
104.权利要求103的方法，其中所述数学模型是一种基于生理学的药代动力学(″PBPK″)模型。
105.权利要求91的方法，进一步包括将微型通透性材料集成为芯片格式。
106.权利要求91的方法，进一步包括提供吸收特性、代谢酶活性和/或表达水平。
107.权利要求91的方法，进一步包括将生物材料定位于微型通透性材料之中、之上或靠近其两侧。
108.权利要求107的方法，其中位于微型通透性材料任一侧上的生物材料为相同的类型或不同的类型。
109.权利要求91的方法，其中所述微型通透性材料包含能够形成汇合单层的细胞系。
110.权利要求91的方法，其中所述结合包括提供选自下列至少一种的粘合剂蛋白质、连接蛋白32、紧密连接蛋白、闭合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘着连接蛋白、E-钙粘蛋白、β-联蛋白、细胞粘附分子和桑椹粘着蛋白。
111.权利要求91的方法，进一步包括提供靠近微型通透性材料的第一侧面的血液替代物流动。
112.权利要求91的方法，进一步包括提供靠近微型通透性材料的第二侧面的胆汁替代物流动。
113.一种形成装置的方法，包括形成一种微型通透性材料，该微型通透性材料构造为结合并且极化表现出肝功能的至少一个特性的物质。
114.一种微型设备，包括
将表现出肝功能的至少一个特性的物质以使该物质极化的方式与微型通透性材料结合的设置。
115.一种装置，包括
微型通透性材料；和
至少一种构造为表现出肝功能的至少一个特性的物质，其中该物质处理的分子被引导通过微型通透性材料的至少一部分。
116.一种方法，包括将物质处理的分子引导通过微型通透性材料的至少一部分，其中该物质设置为表现出肝功能的至少一个特性。
117.一种形成装置的方法，包括形成微型通透性材料，该微型通透性材料构造为将物质处理的分子引导通过微型通透性材料的至少一部分，其中该物质设置为表现出肝功能的至少一个特性。
118.一种装置，包括将物质处理的分子引导通过微型通透性材料的至少一部分的装置，其中该物质设置为表现出肝功能的至少一个特性。
全文摘要
公开了用于微型药代动力学的系统和方法。各种器官和它们与药物化合物的相互作用可以在体外用可通过微型通道相互连接的微型区室(3722、3734、3744)模拟。与这些器官有关的细胞或细胞材料可以在这些区室中培养，以允许它们与在一个或多个流体流中的药物化合物相互作用。这样的流体系统可以包括，例如，胃肠流、血流、胆汁流、尿流和脑液流。流体系统之间的相互作用可以用微型透性膜(3430)模拟。在一个实例中，血液-胆汁相互作用可以用具有通过粘合剂与通透性基板(3432)结合的肝细胞(3434)的微型通透性材料模拟。
文档编号C12M3/06GK101223268SQ200680025975
公开日2008年7月16日 申请日期2006年5月17日 优先权日2005年5月18日
发明者G·T·巴克斯特, R·弗里德曼, A·辛, M·舒勒, S·迈耶斯, A·哈里森 申请人:康奈尔研究基金会(有限公司)