专利名称：：天冬酰胺和蛋白被增强的玉米植株和种子的制作方法天冬酰胺和蛋白孝皮增强的玉米植林和种子发明背景本申请要求2005年5月16日提交的美国临时申请序号60/681,348的优先权，该临时申请的完整公开内容在此引入作为参考。1.发明领域本发明一般地讲涉及植物生物
技术领域：
，更具体地讲涉及增强玉米植抹和种子中的天冬酰胺和蛋白。2.相关领域描述农民和消费者期望玉米才直一朱具有改良的农艺性状，例如增加的产量、增加的种子蛋白产量和改良的营养组成。期望的玉米植株营养成分尤其包括纤维、抗氧化物如维生素E、硒、铁、镁、锌、维生素B、木脂体类、酚酸(phenolicacid)、必需氨基酸和植物雌激素(phytoestrogen)。尽管在植物育种方面的相当大的努力已提供了一些在这些所需性状方面的获益，但将特定非宿主DNA导入植物基因组中的能力进一步提供了产生具有这些性状的植林的机会。具体地说，尽管常规玉米的产量在这几年中稳定增长，但玉米冲直林更有效地同化氮或增加种子蛋白含量的能力还没有类似的增加。氮利用度对植物生产率、生物量和作物产量(包括种子蛋白产量)具有显著的积极作用。在植物中，无机氮由土壤中被同化，还原为氨，并以转运氮的氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的形式掺入到有机氮中。天冬酰胺(Asn)因为其高氮碳比(2N:4C对2N:5C)和因为其相对惰性而成为一种优选的酰胺转运分子。Asn和其它氨基酸还用作蛋白合成的组件。在植物中，Asn在由天冬酰胺合成酶(AsnS)催化的反应中由谷氨酰胺、天冬氨酸和ATP合成。谷氨酸、AMP和焦磷酸作为副产物生成。业已描述了两种形式的AsnS:谷氨酰胺依赖性形式和氨依赖性形式。谷氨酰胺依赖性AsnS既可催化谷氨酰胺依赖性反应，也可催化氨依赖性反应，但谷氨酰胺是优选的氮源。高蛋白浓度被认为是包括大豆、玉米和小麦在内的大部分主要作物的一种重要品质。例如，已通过传统育种鉴别出高蛋白玉米、小麦和大豆品种。但是，以此方式幵发的大部分高蛋白系具有产量下降或其它农艺劣势。如果作物(尤其是玉米)的蛋白含量能增加至目前可获水平之上，则其对人食用和产物在动物饲料中的应用都应当是合乎需的营养价值的利益。发明概述本发明提供了一种用于处理作物和其它植物制品以便增加植物中的蛋白和to酸含量的方法和组合物。所述方法和组合物增加玉米组织、尤其是种子中的游离氨基酸和蛋白水平。更具体地说，提供在其基因组中含异源DNA组合物的转基因玉米植林和种子，所述异源DNA组合物所表达的基因产物涉及增加的天冬酰胺和增加的蛋白生物合成。所述产物的表达增强食用和飼用玉米源及得自转基因玉米种子或其部分的加工制品的营养Y介值。在一个方面，本发明提供增加玉米植抹中的蛋白含量的方法。还包括一种扭自SEQIDNOl、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16和17的多核苦酸序列的DNA构建物，其中所述多核苷酸分子编码天冬酰胺合成酶多肽或具有天冬酰胺合成酶活性的多肽。在一个实施方案中，本发明包括用异源DNA组合物转化的玉米植物细胞，所述异源DNA组合物编码纟皮鉴别为SEQIDNO:4的天冬酰胺合成酶。更具体地说，与不表达异源玉米AsnS2多核苷酸分子的相同品种的玉米才直4朱相比，异源玉米AsnS2(天冬酰胺合成酶同功酶2)多核苷酸分子在转基因玉米才直林中的表达导致转基因植抹(例如转基因玉米植抹种子)中的天冬酰胺和蛋白水平提升。本发明还涉及动物饲料，所述动物飼料含有上述蛋白或氨基酸含量增加的种子，或这些种子的加工制品，例如粗粉。因此，本发明还包括含天冬酰胺合成酶的玉米种子，所述天冬酰胺合成酶通过含编码玉米天冬酰胺合成酶的DNA分子的异源DNA构建物的表达而产生。这类种子的一个实施方案是收获的谷粒，本发明还包括由这些谷粒制备的粗粉、谷蛋白和其它玉米制品。本发明包括含SEQIDNO18-45中的一个或多个的分离的核酸引物序列或其互补物。本发明包^"检测或鉴别转化植林或其子代的基因组中编码本发明植物AsnS多肽或具有AsnS活性的植物多肽的异源多核苷酸分子的方法，所述多核苷酸分子包*自SEQIDN018-45的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子在DNA扩增方法中用作DNA引物。附图筒述图1图示了pMON79706的质粒图谱。图2图示了pMON66229的质粒图谱。图3图示了pMON66230的质粒图谱。图4图示了pMON66231的质粒图谱。图5图示了pMON66239的质粒图谱。图6，在pMON79706事件中的转基因表达。误差棒代表95%置信区间，对于转基因事件11=5,对于近交系对照11=10。图7,在pMON92870事件中的转基因表达。误差棒代表95%置信区间，对于转基因事件n〉3林植林，对于近交系对照11=8林植林。核酸序列和多肽序列的描述SEQIDNO:1是编码玉米(Zeawa，)AsnSl的多核苦酸序列。SEQIDNO:2是玉米(ZeaAsnSl多肽。SEQIDNO:3是编码玉米(Zeawa，)AsnS2的多核苦酸序列。SEQIDNO:4是玉米(ZeaAsnS2多肽。SEQIDNO:5是编码玉米(Zeama_ys)AsnS3的多核苦酸序列。SEQIDNO:6是玉米(Zeawa")AsnS3多肽。SEQIDNO:7是编码大豆(G/少c/"ewax)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:8是大豆(G(y"力emax)AsnS多肽。SEQIDNO:9是编码苟养木杆菌(;^/￡//0/"劝^0)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:10是编码野油菜黄单胞菌(Z(3"f/om朋asca附pe对n力AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:11是编码嗜石威芽孢杆菌(3ad〃ws/w/o血ra"力AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:12是编码水稻((9^yzaAsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:13是编码红'藻(GflW/erZa^///mran'a)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:14是编码红藻(GaW/e"'asw/p/mrahfif)AsnS的多核苷酸序列。SEQIDNO:15是编码红'藻(Ga/fi^"'ara/p/mraha)AsnS的多核香酸序列。SEQIDNO:16是编码红藻(G"/力e厂Zaw/p/^raha)AsnS的多核苦酸序列。SEQIDNO:17是编石马酿酒酵母(Sacc/2aram;;cMcerev/w'ae)CGPG3913AsnS的多核普酸序列。SEQIDNO:18是正向(f)AsnSPCR引物序列。SEQIDNO:19是正向(f)AsnSPCR引物序列。SEQIDNO20-43是用于Gateway克隆法的初级和次级的正向(f)和反向(r)AsnSPCR引物序列。SEQIDNO:44，正向(f)AsnSPCR引物序列SEQIDNO:45，正向(f)AsnSPCR引物序列SEQIDNO:46，ZmASSense引物。SEQIDNO:47，ZmASAntisense引物。SEQIDNO:48,玉米AsnS3正向引物。SEQIDNO:49，玉米AsnS3反向引物。发明详述以下是本发明的详述，提供此详述是为了帮助本领域技术人员实施本发明。除非本文另有定义，否则术语按照相关领域一般技术人员的常规用法理解。分子生物学中普通术语的定义还可见于Rieger等,1991;和Lewin,1994。使用陈述于37CFR§1.822的DNA碱基命名法。使用氨基酸残基的标准单字母和三字母命名法。在不偏离本发明的精神或范围的情况下，本领域一般技术人员可对本文所述实施方案实施修改和变更。本发明提供一种方法，该方法通过将在转基因植物细胞中表达AsnS多肽的异源多核苷酸导入玉米植物细胞基因组中增加玉米植抹中的蛋白含量。本发明提供含(含意味着"包括但不限于")编码AsnS多肽的多核苷酸分子或多核苷酸分子区段的DNA构建物，其中所述AsnS多肽可选地有效连接至叶绿体转运肽。编码AsnS多肽或其类似物或等位基因的多核苷酸分子或编码转运肽或标记/报告基因的多核苷酸分子是"分离的"，也就是说它们已至少部分地在体外制备，例如分离自其天然状态、分离自细胞、纯化和扩增，例如它们与对通常被发现以其天然状态与它们结合的那些元件来说是异源的遗传元件相结合。本文使用的已导入到宿主细胞中的含AsnS编码多核苷酸分子的异源DNA构建物，优选与以其天然未转化态存在于细胞中的任意多核香酸分子都不相同，并就存在于宿主细胞基因组中的其它DNA分子而言是分离的。本文使用的在转化植物、植物组织或植物细胞中的"改变的或增加的"天冬酰胺水平是大于在未含本发明DNA构建物的对应植物、植物组织或植物细胞中存在的水平。本发明的物质还可以是重组体。本文使用的术语重组体指得自多核苷酸分子的人为操作或由多核苦酸分子的人为操作产生(但间接地产生)的任意物质(例如DNA、肽等)。在一个优选方面，如本文所用的种子营养质量的增强(例如增加的种子蛋白含量)依据植物生产下述种子的能力测定，所述种子具有的蛋白或营养成分产量比在蛋白或营养质量方面无此增加的种子高。在本发明的一个特别优选的方面，相对于与营养增强植物具有相似遗传背景的植物检测营养质量的增加，在本文的异源DNA构建物中描述的表达或过表达蛋白或片段的本发明植物除外。多核苷酸分子本发明包括和提供在其基因组中含转基因的转基因玉米植林和种子，所述转基因包含编码玉米天冬酰胺合成酶(Zm.AsnS2)的异源DNA分子，所述DNA分子例如包含SEQIDNO:3和与这些序列具有至少90%、95%或99%同一性且具有功能性天冬酰胺合成酶活性的序列。本发明的另一方面是一种通过将DNA构建物导入玉米细胞中增加玉米植林中的蛋白的方法，所述DNA构建物提供编码天冬酰胺合成酶的异源多核苷酸分子，例如SEQIDNOl、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16和17。所述多核苷酸可与这些实例中的任一种不同，但不改变其编码的多肽。例如，能够编码这些保守氨基酸置换的密码子当然是本领域已知的。另外，本发明预期，在本发明中可使用其中已缺失、置换或添加一个或多个氨基酸而不改变天冬酰胺合成酶功能的多肽。在本发明的一个方面，本发明的多核苷酸被称作是导入的多核苷酸分子。如果多核苦酸分子由于人为操作被插入到细胞或生物中，无论怎样间接，该多核苷酸分子都被称作是"导入的"。导入的多核苷酸分子的实例包括但不限于已通过转化、转染、注射和射流(projection)导入到细胞中的多核苷酸，以及已通过缀合、内吞、吞噬作用等导入到生物中的多核香酸。优选地，将所述多核苷酸插入到细胞基因组中。一个亚组的本发明多核苷酸分子是片段多核苷酸分子。片段多核香酸分子可由相当大部分的或实际上大部分的本发明多核苷酸分子，例如具体公开的那些多核普酸组成。备选地，所述片段可包含较小的寡核苷酸(具有约15个至约40O个核苷酸残基，更优选具有约15个至约30个核香酸残基，或具有约50个至约IOO个核苷酸残基，或具有约100个至约200个核苷酸残基，或具有约200个至约400个核苷酸残基，或具有约275个至约350个核苷酸残基)。本发明的一种或多种多核香酸分子的片段可为探针以及具体为PCR引物分子。PCR引物是一种在与另一种多核苷酸形成双链结构时能够启动聚合酶活性的多核香酸分子。本领域有各种备样的测定PCR探针结构的方法和PCR技术。如果本文使用的两种多核苷酸序列能够形成反平行的双链多核苷酸结构，则认为这两种分子能够彼此特异性杂交。如果一种多核普酸分子与另一种多核苷酸分子表现出完全的互补性，则这种多核苷酸分子认为是所述另一种多核苷酸分子的"互补物"。如本文所用的，当分子的每个核苷酸都与另一种分子的核苷酸互补时，则认为所述分子表现出"完全互补性'，。如果两种分子可彼此杂交，其稳定性足以允许它们在至少常规的"低严格，，条件下保持彼此退火，则这两种分子被认为是"最低互补的(minimallycomplementary)"。同样，如果分子可彼此杂交，其稳定性足以允许它们在至少常规的"高严格"条件下保持彼此退火，则两种分子被认为是"互补的"。常规的严格条件描述于Sambrook等，(2001)和Haymes等，(1985)。因此，与完全互补性的偏离是允许的，只要这种偏离未完全排除分子形成双链结构的能力。因此，为使多核苷酸分子用作引物或探针，其仅需足以能够在所用特定溶剂和盐浓度下形成稳定双链结构的序列互补性。促进DNA杂交的适宜严格条件是例如6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、约45。C，接着于20-25。C用2.0XSSC清洗，这些条件是本领域技术人员已知的，或者可见于Ausubel等编辑，(1989),6.3.1-6.3.6节。例如，清洗步骤的盐浓度可选自约2.0XSSC、5(TC的低严才各性至约0.2XSSC、65。C的高严格性。另外，清洗步骤中的温度可由室温约22。C的低严格条件至约65。C的高严格条件。温度和盐都可变，或者温度和盐浓度中的任一种可保持恒定，使得核酸将与本文提供的多核苷酸分子(例如SEQIDNO1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18-45所陈述)及其互补物中的一种或多种在中等严格条件(例如约2.0XSSC和约65。C)下特异性杂交。在本发明方法的一个实施方案中，本发明的任一种多核苷酸序列或多肽序列或这二种序列中任一种的片段都可用于检索相关序列。本文使用的"相关序列检索，，指测定两个序列之间相关性的任意方法，包括但不限于对比序列同源性的检索例如，在数据库中对单个多肽序列的关联性进行PBLAST检索。其它检索可使用基于轮廓(profile)的方法进行，例如HMM(隐马尔可夫模型(HiddenMarkovmodel))META-MEME,其由南达科他州的南达科他州立大学(SouthDakotaStateUniversity,SD)维护，以及PSI-BLAST,其由国立卫生研究所国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnilogyInformation,NationalLibraryofMedicine,NationalInstituesofHealth,NCBI)维护。多核苷酸分子可编码基本相同或基本同源的多肽分子。同一性或同源性的程度可通过使用计算机软件如WISCONSINPACKAGEGap程序确定。GeneticsComputerGroup,Inc.的WISCONSINPACKAGE10.0版-UNIX中的Gap程序基于Needleman和Wunsch,1970的方法。使用BLAST2.2.1软件套装中的TBLASTN程序(Altschul等，(1997))或使用BLOSUM62矩阵(Henikoff和Henikoff,1992)。本发明的多核苦酸分子还可以编码同系物多肽。本文使用的同系物多肽分子或其片段是在第二个物种中的对应蛋白或其片段(例如玉米rubisco(核酮糖二磷酸羧化酶-力口氧酶)小亚基是拟南芥rubisco小亚基的同系物)。同系物还可以通过分子进化或DNA改组技术产生，使得所述分子保留原始多肽的至少一种功能性或结构性特征(参见例如美国专利5,811,238)。在一个优选实施方案中，本发明的任一种多核苷酸分子都可有效连接至在植物细胞中用于引起mRNA分子产生的启动子区，其中，连接至启动子的多核苷酸分子对该启动子而言是异源的。本文使用的"异源"DNA是天然并不紧邻相邻DNA的任意DNA序列。"天然的，，指天然存在的核酸序列。"异源"序列经常起源于外部来源或物种，或者如果来自相同来源，则由其原始形式和/或基因组中的位置改变。本文使用的术语"蛋白"、"肽分子"或"多肽"包括含5个或多个氨基酸的任意分子。在本领域众所周知，蛋白、肽或多肽分子可经历修饰，包括翻译后修饰，例如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，本文使用的术语"蛋白"、"肽分子"或"多肽"包括通过任意生物或非生物过程修饰的任意蛋白。术语"氨基酸"和"多个氨基酸"指所有天然存在的L-氨基酸。该定义意味着包括正亮氨酸、正缬氨酸、乌氨酸、高半胱氨酸和高丝氨酸。"蛋白片段"是其氨基酸序列包含该蛋白的一部分氨基酸序列的肽或多肽分子。含一个或多个不来源于该蛋白的额外肽区的蛋白或其片段是"融合，，蛋白。此类分子可被衍化，以包含糖或其它部分(例如匙孔蜮血蓝蛋白)。本发明的融合蛋白或肽分子优选经重组手段生产。植物构建物和植物转化体一种或多种编码天冬酰胺合成酶的本发明DNA构建物可用于植物转化或转染。可将外源遗传物质转移入植物细胞中，并使植物细胞再生为全林、可育林或不育抹。外源遗传物质是能够插入到任意生物中的任意来源的任意遗传物质，无论是不是天然存在的。在本发明的再一方面，本发明的多核苷酸序列还编码参与胞内定位、输出或翻译后修饰的肽，例如叶绿体转运肽。本文使用的术语"基因"包括提供转录调节的核酸分子，该分子包含在植物中有功能的启动子、5'非翻译分子如内含子和前导序列、转录的核酸分子和3'转录终止分子。编码本发明多肽的多核酸分子可以各种方式与其它非天然的或异源的序列组合。所述"异源"序列指未^H现与编码本发明多肽的核苷酸序列天然接合的任意序列，包括例如未被发现天然接合在一起的相同植物的核苷S吏序列的组合，或源于两个不同物种的两种序列的组合。术语"有效连接的(operablylinked)"用于指调节性或结构性多核苷酸分子的物理和功能性排列，该排列使有效连接的结构性多核苷酸分子的表达受调节。DNA构建物或转基因的表达指来源于本发明的多核苷酸分子或其翻译的有义或反义RNA或者蛋白的转录和稳定累积。"有义"RNA指包含mRNA的RNA，所以可被细胞翻译为多肽或蛋白。"反义RNA"指与全部或部分的目标初级转录物或mRNA互补并阻断目标基因表达的RNA转录物(美国专利5,107,065，在此引入作为参考)。反义RNA的互补性可针对特定基因转录物的任意部分，即针对5'非编码序列、3'非翻译序列、内含子或编码序列。"RNA转录物"指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，其被称为初级转录物，或者其可为来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列，称为成熟RNA。本文使用的术语植物表达盒指含必需DNA调节分子的构建物，其中所述调节分子有效连接至靶分子，以提供在植物细胞中的表达。在一个实施方案中，本发明的DNA构建物可包含引起本发明多肽过表达的启动子，其中"过表达"指多肽的表达一般在宿主细胞中不存在，或者以比编码所述多肽的内源基因正常表达高的水平存在于所述宿主细胞中。可引起本发明多肽过表达的启动子一般来说是本领域已知的，提供组成型表达模式的启动子实例包括花椰菜花叶病毒19S启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子(美国专利5,352,605)、玄参花叶病毒3SS启动子(美国专利6,051/753)、甘蔗杆状病毒启动子(美国专利5,994,123)、鸭跖草黄化斑驳病毒启动子(Medberry等，1992)、核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶启动子、腺噤呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1启动子(美国专利5,641,876)、玉米遍在蛋白启动子、甘露碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子。这样的遗传构建物可转移到单子叶或双子叶植物中，所述植物包括但不限于苜蓿、苹果、拟南芥04ra6/cfo戸,;y)、香蕉、油菜08ra肌cacampeWn力、canola、荒麻子、咖啡、玉米、棉花、棉籽、菊花、海甘蓝、黄瓜、石槲属(Dem/raZ)h/w)物种、薯蕷属(Z)^wcorea)物种、桉树、羊茅、亚麻、剑兰、百合、亚麻子、黍、香瓜、芥菜、燕麦、油椰子、油料油菜(oilseedmpe)、花生、黑麦草、菜豆属(尸/2aye0/w力、水稻、高粱、大豆、黑麦、tritordeum、草坪草、小麦、红花、芝麻、甜菜、甘蔗、酸果蔓、番木瓜、红花和向日葵(Christou,1996)。在一个优选实施方案中，所述遗传物质^t转移到玉米细胞中。编码蛋白的多核苷酸分子的转移可导致该多肽在转化细胞或转基因植物中表达或过表达。由本发明的多核香酸分子编码的一种或多种蛋白或其片段可在转化细胞或转化植物中过表达。在一个实施方案中，本发明的DNA构建物包含编码多肽序列的多核苷酸分子，所述分子选自SEQIDNOl、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16和17。本发明提供转化玉米细胞，其中，相对于无此DNA构建物的未转化玉米植林，所述细胞具有增强的天冬酰胺水平。在另一个实施方案中，本发明的DNA构建物包含有效连接至玉米天冬酰胺合成酶编码序列的异源DNA分子，例如SEQIDNO1、3或5,所述DNA构建物被转化入玉米细胞。在一个优选实施方案中，含SEQIDNO:3的本发明DNA构建物在转化的玉米细胞中提供，DNA构建物的表达提供了相对于未用该DNA构建物转化的玉米植林具有增加的天冬酰胺的玉米植才朱或具有增加的蛋白的玉米植才朱种子。在某些实施方案中，一种或多种AsnS产物的水平可在整个植才朱中增加，或位于植4朱的一个或多个特定器官或组织中。在不限制本发明范围的情况下，几种启动子序列对表达上述酶的基因有用。例如，玉米C4型PPDK启动子(Glackin等，1990)、玉米C4型PEPC启动子(Hudspeth和Gmla,1989)、水稻Rubisco小亚基启动子(Kyozuka等，1993)和集光叶绿素a/b结合蛋白启动子(Sakamoto等，1991)、P-FDA启动子(US20040216189A1,其多核苷酸序列在此引入作为参考)和P-RTBV启动子(美国专利5,824,857，其多核苷酸序列在此引入作为参考)。例如，可增加植物的一个或多个组织和器官中的天冬酰胺或蛋白水平，所述组织和器官包括但不限于根、块茎、茎、叶、柄、果实、浆果、坚果、皮、荚、种子和花。优选器官是种子。为了在植物源组织如叶、种子、根或茎中表达，优选所用启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。本发明蛋白的组织特异性表达是特别优选的实施方案。DNA构建物或载体还可包括目标编码区和完全或部分用于终止该区域转录的多核苷酸序列。已分离出许多这样的序列，包括T-NOS3'区(Ingelbrecht等，1989;Bevan等，1983)。调节性转录终止区同样可在本发明的植物表达构建物中提供。转录终止区可由编码目标基因的DNA序列提供，或者可由来源于不同基因源的便利转录终止区提供，例如与转录起始区天然结合的转录终止区。技术人员将认识到，任何建物中。载体或构建物还可包括调节元件，例如内含子。其实例包括Adh内含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等，1989)、hsp70内含子(美国专利5,859,347)和TMVco元件(Gallie等，1989)。适宜时可纳入这些调节元件和其它调节元件。载体或构建物还可包括选择标记。选择标记还可用于选择含外源遗传物质的植物或植物细胞。选择标记的实例包括但不限于weo基因(Potrykus等，1985),其编码卡那霉素抗性，可使用卡那霉素、nptll、G418、hpt等选择；bar基因，其编码双丙氨磷(bialaphos)抗性；突变型EPSP合酶基因，其编码草甘膦抗性(Hinchee等，1988;Reynaerts等，1988;Jones等，1987);腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈(bromoxynil)抗性(Stalker等，1988);突变型乙酰乳酸合酶基因，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(ALS)(美国专利4,761,373;D'Halluin等，1992);和DHFR基因，其抗氨甲蝶呤(Thillet等，1988)。植物转化最常用的植物细胞转化方法是农杆菌介导的DNA转移法以及粒子轰击或微弹轰击介导的方法(即基因枪)。通常，期望核转化，但如果期望特异性转化质体，例如叶绿体或造粉体，则可利用微弹介导传递所需多核苷酸来转化植物质体。通过农杆菌介导的转化将转基因导入植物中的方法使用T-DNA(转移DNA)，其掺入转基因的遗传元件，并将这些遗传元件转移入植物基因组中。一般来说，将边界为右边界DNA分子(RB)和左边界DNA分子(LB)的转基因转移到植物基因组中的单个基因座。"T-DNA分子"指经农杆菌介导的转化法整合入植物基因组中的DNA分子。T-DNA分子的末端在本发明中被限定为侧接农杆菌Ti质粒的T-DNA的边界区。这些边界区一般来说被称为右边界(RB)区和左边界(LB)区，以核苷酸序列和长度可变的形式存在，这取决于它们是来源于生产胭脂碱还是章鱼碱的农杆菌菌林。在设计用于将转基因转移到植物中的DNA构建物中常用的边界区经常有数百个多核苷酸长，含切口位点，在该位点处内切核酸酶消化DNA,以提供用于插入到植物基因组中的位点。T-DNA分子一般包含一个或多个植物表达盒。对于微弹轰击(美国专利5,550,318、5,538,880和5,610,042,每个均明确地整体在此引入作为参考)，粒子用多核苷酸包被，并通过推进力传递入细胞中。示例性粒子包括由钨、铂和优选金构成的那些粒子。通过粒子加速将DNA传递入植物细胞中的有用方法是BiolisticsParticleDeliverySystem(BioRad,Hercules,California),其可用于推动将包被有DNA或细胞的粒子穿过屏(例如不锈钢或Nytex屏)而推进到覆盖有悬浮培养的单子叶植物细胞的滤器表面上。微弹轰击技术可广泛应用，可用于转化实际上任意植物物种。已通过微弹轰击转化的物种实例包括单子叶植物物种，例如玉米(PCT公开说明书WO95/06128)、大麦、小麦(美国专利5,563,055,其整体在此引入作为参考)、水稻、燕麦、黑麦、甘蔗和高粱；以及许多双子叶植物，一般来说包括烟草、大豆(美国专利5,322,783,其整体在此引入作为参考)、向曰葵、花生、棉花、番茄和豆科植物(美国专利5,563,055,其整体在此引入作为参考)。不考虑转化方法，为选择或记录转化植物细胞，被导入细胞中的DNA含有在可再生植物组织中有功能以产生化合物的基因，该化合物赋予植物组织对在其他情况下有毒的化合物的抗性。用作可选择、可筛选或可记录标记的目标基因应包括但不限于GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、愛光素酶(LUX)以及抗生素或除草剂耐受基因。抗生素抗性基因的实例包括赋予针对卡那霉素(和新霉素、G418)和博来霉素的抗性的基因。由各种转化外植体再生、发育和栽培植抹在本领域已有充分文件记载。此再生和培养方法通常包括以下步骤选择转化细胞，并培养这些个性化细胞通过通常的胚发育期至生根的幼苗期。转基因胚和种子类似地再生。此后将所获转基因生根枝条种植在适宜的植物生长培养介质如土壤中。经受得住接触选择剂的细胞或已在筛选测定中记录为阳性的细胞可在支持植林再生的培养基中培养。将发育中的幼苗转移至无土植物生长混合物中，并进行幼苗锻炼，然后转移至温室或生长室让其成熟。对任意转化细胞或组织均可使用本发明。本文使用的所谓可转化的指能够进一步繁殖以产生植株的细胞或组织。技术人员知晓，许多植物细胞或组织是可转化的，其中在插入外源DNA和适合的培养条件之后，所述植物细胞或组织可形成分化的植株。适于这些用途的组织可包括但不限于未成熟胚、盾片(scutellar)组织、悬浮细胞培养物、未成熟花序、枝条分生组织、茎段外植体、愈伤组织、胚轴组织、子叶、根和叶。可使用任意合适的植物培养基。适宜培养基的实例应包括但不限于基于MS的培养基(Murashige和Skoog,1962)或基于N6的培养基(Chu等，18:659,1975),它们补加额外的植物生长调节剂，这些植物生长调节剂包括但不限于植物生长素(auxin)、细胞分裂素、ABA和赤霉素。本领域技术人员熟知各种组织培养基，其在适宜地补加时支持植物组织生长和发育，并适于植物转化和再生。这些组织培养基可作为商品购买，或自行制备和改变。本领域技术人员知晓，用于转化和再生的培养基和培养基补加物，例如营养物和生长调节物，以及其它培养条件，例如培养过程中的照度、pH和培养温度，可对具体目标品种优化。本发明的任一种多核苷酸分子都可与其它遗传元件(例如载体、启动子、增强子等)组合在一起以永久或瞬时方式导入到植物细胞中。而且，本发明的任一种多核苷酸分子均可以允许由所述多核苷酸分子编码的蛋白或其片段表达或过表达的方式导入到植物细胞中。本发明还提供本发明植物的部分，特别是繁殖部分和贮藏部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠、花粉或块茎。在本发明的一个特别优选的实施方案中，植物部分是玉米种子。在一个实施方案中，玉米种子(或谷粒)是动物祠料的组成部分。在一个优选实施方案中，玉米詞料或得自玉米种子的玉米^^或蛋白设计用于家畜或人或这二者。生产飼料、谷粉和蛋白的方法是本领域已知的。参见例如美国专利4,957,748、5,100，679、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一个优选实施方案中，蛋白制品是高蛋白制品。此高蛋白制品优选具有大于约5%(重量/体积)、更优选大于10%(重量/体积)乃至更优选大于15%(重量/体积)的蛋白含量。常用于不同性状和作物的育种方法的描述可见于若干参考书中的一种(例如Hayward,1993;Richards,1997;Allard,1999)。其它生物本发明的多核苷酸可导入到任意细胞或生物中，例如哺乳动物细胞、哺乳动物、鱼细胞、鱼、鸟细胞、鸟、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌或细菌细胞。本发明的蛋白可在合适的细胞或生物中生产。优选的宿主和转化体包括真菌细胞如曲霉属(A^e^7/w)、酵母、哺乳动物(特别是牛和猪)、昆虫、细菌和藻类。特别优选的细菌是根癌农斥干菌(^4groZa"en'Mm^/mq/^cz.e/is")和大肠冲干菌(5".co//)。在本发明的一个方面，本发明的一种或多种核酸分子用于确定植4勿《尤选canola、玉米、〉、由菜(J5raww'cacaw尸e对^s)、、油泮+、油菜、'油菜沣子、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油椰子、亚麻或向日葵)中的表达水平(即样品中的mRNA浓度等)或部分或全部由本发明的一种或多种多核苷酸分子编码的蛋白的表达模式(即表达动力学、降解速率、稳定性情况等)。许多方法可用于比较两种或多种细胞或组织样品之间的表达。这些方法包括杂交测定，例如RNA印迹测定、RNA酶保护测定和原位杂交。备选地，所述方法21包括PCR型测定。在一个优选方法中，通过将来自两个或多个样品的多核苷酸与多核苷酸阵列杂交来评价表达。所述阵列包含多种已知或怀疑存在于细胞或组织样品中的怀疑序列。纳入以下实施例是为了阐述本发明的各个方面，根据本文的公开内容，本领域技术人员应认识到，可在所公开的具体方面做出许多改变，仍获得类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。实施例本领域技术人员会认识到本发明提供的方法和组合物的许多优势。纳入以下实施例是为了证明本发明的优选实施方案。本领域技术本发明实施中运行良好的技术，因此可神皮认为构成了用于本发明实施的优选模式。但是，按照本文的公开内容，本领域技术人员会认识到，可对所公开的具体实施方案做出许多改变，仍获得类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。本文提及的所有参考文献都在此引入作为参考，从而它们对本文使用的方法、技术或组合物进行补充、解释、提供背景或讲解。实施例1玉米和大豆植物cDNA和基因组文库的构建该实施例描述了由玉米和大豆植林组织制备的cDNA文库的产生，由这些文库分离出本发明的玉米AsnS和大豆多核苦酸序列。cDNA文库使用本领域已知的技术如Alba,2004由玉米(Zeama，)和大豆(G(yc/"emax)组织产生。玉米cDNA文库由两种不同组织制备。一个文库由在近交系90DDD5的迟緩期(dilatoryphase)收获的初期谷粒制备。第二个玉米cDNA文库由玉米近交系H99的抽丝生长期(silkingphase)的花丝组织(silktissue)和来自玉米近交系M017的萌发中的花粉制备。为由大豆(G(yc/"emox)构建cDNA文库，由A3237品种(Asgrow)的再水合干大豆种子切下分生组织和部分胚轴。外植体如下制备首先使经表面消毒的种子在固体组织培养基上于28。C以18小时光照/日发芽6天，然后将发芽种子转移至4。C达至少24小时。对于用于文库制备的组织，去除子叶，以富集特定目标组织。使用0.5-2g组织制备总RNA和polyA+RNA。对于所有的cDNA文库，收集植物组织，并立即冷冻在液氮中。收获的组织储存于-8CTC,直至制备总RNA。总RNA4吏用InvitrogenCorporation(InvitrogenCorporation,Carlsbad,California,U.S.A.)的Trizol试剂基本如生产商所推荐的纯化。PolyA+RNA(mRNA)使用磁性oligodT珠基本如生产商(Dynabeads,DynalBiotech,Oslo,Norway)所4,荐的纯化。植物cDNA文库的构建在本领域众所周知，存在许多克隆策略。许多cDNA文库构建试剂盒是商品化的。使用用于cDNA合成和质粒克隆的SuperscriptTM质粒系统(InvitrogenCorporation)如在SuperscriptIIcDNA文库合成方法中所述制备cDNA文库。检查cDNA文库，以证实合适的插入片段:载体比率。使用下文描述的改良基因组DNA分离法(Dellaporta等，1983)，使用分离自玉米(Zeawa，)的基因组DNA构泉基因组DNA文库。在土壤或培养皿中培育玉米籽苗并收获，在液氮中保持冷冻，直至提取。使用研钵和研棒将组织研磨成细粉，同时用液氮保持组织冷冻。将粉末化组织转移至韦林搅切器，该搅切器含在临使用前加入的200mL冷((TC)DNA提取緩冲液(350mM山梨醇；100mMTris;5mMEDTA;用HCl将pH调至7.5;亚硫酸氢钠，3.8mg/mL)，并以高速匀浆30-60秒。匀浆物通过一层粗棉布过滤，并收集在离心瓶中。然后以2500xg离心样品20分钟，废弃上清液和任何疏松的绿色材料。然后将沉淀重悬浮在1.25mLDNA提取緩冲液中，并转移至50mL聚丙烯管中。然后加入核裂解緩沖液(1.75mL,含200mMTris;50mMEDTA;2MNaCl;2.0。/0(重量/体积)CTAB;pH用HC1调节至7.5)，接着加入0.6mL5%(重量/体积)sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)。轻轻混合管，将样品于65。C温育20分钟。加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，再轻轻混合管。然后以2500xg离心各管15分钟，将获得的上清液转移至干净的管。将等体积的冰冷异丙醇倾倒至样品上，颠倒样品几次，直至形成沉淀。使用玻璃吸管由溶液中取出沉淀，通过使沉淀风干2-5分钟去除残余异丙醇。将沉淀重悬浮在400jiLTE緩冲液(l0mMTris-HCl、lmMEDTA，pH调节至8.0)中。实施例2通过非连接反应依赖性克隆法和Gateway克隆法分离」幼S多核苦酸序列和玉米转化该实施例阐述了使用非连接反应依赖性克隆法(ligationind印endentcloning)和Gateway⑧克隆法分离编码AsnS的多核普酸序列，以及含编码AsnS多肽的多核普酸分子的本发明DNA构建物的构建，其中所述AsnS多肽分离自如表1所述的各种植物和微生物源。用于驱动所连接的AsnS编码多核苷酸分子表达的启动子分子是水稻肌动蛋白1启动子P-Os.Actl(美国专利5,641,876，在此引入作为参考)；玉米(Zeama，)PPDK(Matsuoka等，1993)、P-RTBV-1(美国专利5,824,857，在此引入作为参考)和P-Zm.NAS(编码玉米的烟酰胺合酶2多肽的基因组区的启动子分子)。表1.AsnS编码序列源、启动子和DNA构建物<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>非连接反应依赖性克隆^支开发用于克隆PCR产物，基于非回文单链末端的退火。LIC是一种有效的克隆方法，其不受限制位点的限制，或不受需要限制酶消化或连接反应的限制，并允许无缝接合(Aslanidis和deJong，1990)。通过使用"切口内切核酸酶(nickingendonuclease)"和限制性内切核酸酶在载体中产生末端单链DNA区^R。切口内切核酸酶是切断多核苦酸双链中一条链以在克隆载体上产生单链尾的内切核酸酶。载体首先用标准限制性内切核酸酶线性化。然后用切口内切核酸酶消化。在热处理后，在载体中产生末端单链DNA区段。推荐约55%的GC含量用于下游PCR扩增和有效退火。可将启动子、标记或其它序列元件加入到PCR扩增产物的5'和3'末端，以产生可用于下游应用的线性构建物。由基础载体pMON82060和如SEQIDNO5提供的编码AsnS多肽的玉米j训S3多核苷酸分子来组装DNA构建物pMON92870。使用限制性内切核酸酶Hpal质粒骨架pMON82060线性化。然后用切口内切核酸酶N.BbvCIA(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)处理质粒骨架。在消化后，将反应物加热至65'C。这引起被切断的DNA链与其互补DNA链解离。获得的线性化质粒骨架留下两个可用于组装的末端单链DNA区段。用聚合酶链反应在编码AsnS的DNA分子中产生末端单链DNA区段。编码AsnS多肽的玉米4mS3多核苷酸序列(SEQIDNO:5)用于设计正向PCR引物(SEQIDNO:48)和反向PCR引物(SEQIDNO:49):SEQIDNO:48:GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATCSEQIDNO:49:GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCAGACCGCG使用高保真度热聚合酶KOD热启动DNA聚合酶(Novagen,Madison,WI)进行聚合酶链反应扩增。聚合酶链反应在含IXKOD热启动DNA聚合酶緩冲液、1M甜菜碱(Sigma,St.Louis,MO)、1mMMgS04、250|uMdNTP、5pmol各种引物和1单位KOD热启动DNA聚合酶的25体积中进行。聚合酶链反应使用以下循环仪参数在PTC-225DNAEngineTetracFM热循环仪(MJResearchInc.,Waltham,MA)中进行:1.94°C,2分钟2.94°C,15秒3.70°C，30秒(每循环4.72°C，5分钟5.转到步骤2，9次6.94°C，15秒7.60°C,30秒8.72°C,5分钟9.转到步骤6，24次10.72°C,10分钟11.l(TC保持12.结束进行第二轮聚合酶链反应，以在其中产生末端单链DNA区段的区域中导入尿苷残基。许多DNA聚合酶不能读取DNA才莫板链中的尿苷残基，或者不能使用尿苷残基来聚合链。因此使用能够掺入和读取尿香的酶(ExpandHighFidelityplusPCRSystem;Roche,Indianapolis:IN)进行聚合酶链反应。该方法的改进和提供预期结果的其它方法的使用是本领域技术人员已知的。将组装的DNA构建物转化入ElectroMAXTMDH10B大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。将0.5(微升)等份的组装反应物与20jaLElectroMAXDH10B感受态细胞在水上混合，并加载入MicroPulser0.2mm电穿孑L池(Bio國RadLaboratoriesInc.,HerculesCA)中，用于电穿孔。使用165-2100MicroPulser电穿孔仪(Bio-RadLaboratoriesInc.)以1.8kV对细胞进行电穿孔。经电穿孔的细胞在180SOC培养基(InvitrogenInc.)中于37。C温育1小时。然后将细胞接种在含壮观霉素(75mg/L)的LB琼脂平板上，并于37。C过夜培养。选择菌落，并在LB培养基中于37。C过夜培养。使用QIAprepSpin小型制备试剂盒(QIAgenSciences,Valencia,CA)分离质粒DNA构建物。用ABI3730x1DNAAnalyzer使用BigDyeTerminator(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)进4亍DNA测序。使用"Gateway⑧克隆法"，如生产商(InvitrogenCorp.)所述，完成编码玉米j训S2、大豆JmS和酵母AmS7的多核苷酸序列的克隆。Gateway⑧克隆法(通路克隆法)的目标是制备表达克隆。该两步法包括首先将目标基因克隆入入门载体中，接着将目标基因由入门载体(entryvector)亚克隆入目的载体(destinationvector),以产生表达载体。该克隆技术基于X噬菌体所使用的位点特异性重组系统，以将其DNA整合入大肠杆菌染色体中。将用于随后的重组克隆的DNA构建物一两个或重组序列克隆入重组载体中，侧接壮观霉素/链霉素抗性基因(SPC/STR)和AsnS编码多核苷酸序列。使用初级和次级引物序列(SEQIDNO20-43)由从其各自物种制备的cDNA文库或基因组文库分离编码AsnS的多核苷酸序列。将连续的a"Bl/Rl、SPC/STR基因、AsnS基因和加B2/R2序列作为单个多核苷酸分子移入用于在植物细胞中表达的重组构建物中，这些重组构建物是称为pMON79706(玉米AsnS2)、pMON79700(大豆AsnS)或pMON79653(酸酒酵母AsnS)的双链DNA质粒。这些DNA构建物包含农杆菌右边界(O-OTH,RB)区和左边界(LB)区，以及由Herrem-Estrella等，1983;Bevan,1984;Klee等，1985公开的其它元件，e35S启动子(P-CAMV.35S,串联重复的增强子，美国专利5,322,938)、a"Bl/Rl遗传元件(0-Lam.a"Bl/Rl)、SPC/STR基因、对应的AsnS编码区(CR)、加B2/R2遗传元件(0-Lam.诚B2/R2)、马铃薯蛋白酶抑制剂II终止子(St.Pis)、农杆菌NOS启动子(P-AGRtu..nos,Fraley等，1983)、农杆菌左边界(O-OTH,LB)、卡那霉素抗性基因(CR-OTH.-Kan，美国专利6,255,560)以及大肠杆菌复制起点(Ec.ori.ColE)。对于pMON79706、pMON79700或pMON79653，在氯霉素选择(25ng/mL)和卡那霉素选择(50吗/mL)下在LibraryEfficiencyDB3.1TM细胞(InvitrogenCorporation)中扩增DNA构建物。载体DNA使用QIAGEN质粒试剂盒(QIAGENInc.)由细菌培养物纯化。如在美国专利第5,015,580号中所述，使用放电粒子加速基因传递装置将pMON79700、pMON79706和pMON79653的DNA导入玉米胚中。对于LH59预培养的未成熟胚的微弹轰击，优选使用最大电压的35%-45%。在微弹轰击后，将玉米组织在27。C于黑暗中培养。用于制备本发明的转基因植物的转化方法和材料，例如各种培养基和受体耙细胞，未成熟胚的转化和随后的可育转基因植物的再生，公开于美国专利6，194,636和6,232,526以及美国专利申请发明者B·秋,B·费布里,J·克劳利,S·安德森,S·斯克林申请人:孟山都技术有限公司