一种利用外源动物线粒体dna检测地沟油的方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种检测地沟油的方法，尤其是一种利用外源动物线粒体DNA检测地沟油的方法。
技术背景:
[0002]“地沟油”又称为潲水油、泔水油，是质量、卫生极差，过氧化值、酸值、水分、羰基价、丙二醛等指标严重超标的非食用油。其来源主要有:下水道中的油腻漂浮物；将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜经过简单加工、提炼出的油；用于油炸食品的油使用次数超过规定要求，或是劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后产出的油。被捞回的“地沟油”通常会在勾兑一些新油之后流入食品、餐饮行业。地地沟油中重金属、毒素(如丙烯醛、黄曲霉毒素)、过氧化值等都严重超标，并含有洗涤剂等类化学杂质，对人体具有很大危害性，食用后会引起呕吐、头痛、腹泻等不良反应，长期摄入会使细胞功能衰竭，甚至可成为癌变诱因。
[0003]目前，地沟油检测的方法主要有以下几种:1、根据酸价、过氧化值等理化指标进行检测；2、根据地沟油中含有重金属进行检测；3、根据地沟油中含有的动物油脂，通过其胆固醇含量进行检测；4、利用电导率法进行检测；5、利用薄层色谱法对地沟油经高温加热或反复使用后产生的极性物质进行检测；6、利用荧光法检测地沟油外源性污染物质特性(餐具洗涤剂表面活性剂十二烷基苯磺酸钠)的特征荧光波峰为检测对象进行地沟油的检测。
[0004]上述利用地沟油中的外源性物质进行检测方法，由于检测对象含量很少，同时该检测对象无法被有效放大，因此检测的灵敏度不高，准确度不高。
[0005]现有技术中，也公开了一些克服上述不足的技术方案，主要是以地沟油中含有的外源性动物DNA作为检测对象，借助现有的核酸扩增手段，有效放大核酸信号，提高了检测的灵敏度及准确度。
[0006]朱旭平等(专利CN 101906471 A)根据动物线粒体CYTB基因的保守区设计特异性引物，利用荧光定量PCR进行检测，根据结果绝对Ct值进行判定；郭新东等(专利CN102758025 A)根据动物物种牛、羊、猪、鸡保守序列分别设计引物，利用PCR扩增，根据电泳产物进行判定；邓平建等(CN 103290103 A)利用PCR对猪、牛、鸡、哺乳动物等的看家基因进行检测，根据待检油样的扩增DNA片段是否包含一个或多个物种特异性看家基因片段来判定。利用外源动物DNA进行检测，特异性强，灵敏度高，但上述方法中利用结果绝对Ct值进行判定，无法避免检测过程中人员操作，环境等对实验结果的影响，判断存在误差，结果稳定性不高；针对多个检测靶标设计多对引物，成本高，反应体系复杂，结果判定不够准确。
【发明内容】
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[0007]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种利用外源动物特征DNA检测地沟油的方法，来解决现有技术灵敏度不高，稳定性不好，准确度低，成本高的问题。
[0008]一种利用外源动物线粒体DNA检测地沟油的方法，为对待检油提取DNA后，以所提取的DNA为模板，利用实时荧光定量PCR扩增动物线粒体DNA片段，所述动物线粒体DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
[0009]为对待检油提取DNA后，以所提取的DNA为模板，利用实时荧光定量PCR扩增植物叶绿体DNA片段，所述植物叶绿体DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
[0010]以植物叶绿体DNA片段扩增结果为质控线，所述质控线用于检验数据是否可用，以终浓度为10 17M的动物组织DNA标准品Ct值为检测限，当待检测油动物线粒体DNA扩增结果Ct值相对位置在检测限前，即为地沟油。
[0011 ] 所述待检测油动物线粒体DNA片段扩增与所述植物叶绿体DNA片段扩增在相同条件下，同时进行。
[0012]所述动物线粒体DNA片段的核苷酸序列SEQ ID NO:1为:
[0013]GGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCT
[0014]所述植物叶绿体DNA片段的核苷酸序列SEQ ID NO: 2为:
[0015]GCACCCTAGATGGCGAGAGTCCAGTAGCCGAAAGCATCACTAGCTTACGCTCTGACCCGAGTAGCATGGGGCACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCAAGGACCACCTTGCAAGGCTAAATACTCCTGGGTGACCGATAGTGAAGTAGTACCGTGAGGGAAGGGTGAAAAGAACCCCCATCGGGGAGTGAAATAGAACATGAAACCGT
[0016]根据动物线粒体DNA片段的核苷酸序列SEQ ID NO:1获得的动物序列扩增引物序列可以为:
[0017]DW-F:5’-GTTTACGACCTCGATGTTGG-3’ (SEQ ID N0.3)
[0018]DW-R:5，-CTGAACTCAGATCACGTAGGACT-3，(SEQ ID N0.4)
[0019]根据植物叶绿体DNA片段的核苷酸序列SEQ ID NO: 2获得的植物序列扩增引物可以为:ZW-F:5’-GTCCAGTAGCCGAAAGCATCAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0020]ZW-R:5，-TGGTCCTTGCTGATTCACACG-3’ (SEQ ID N0.6)
[0021 ] 所述外源动物线粒体DNA及内源植物叶绿体DNA的查找及其扩增检测通用引物的设计:
[0022]所述外源动物线粒体DNA及内源植物叶绿体DNA的查找:以地沟油中常含有的猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼为地沟油检测的主要外源动物物种，所述猪选取大白猪、家猪、杜洛克猪、金华猪、兰德斯猪、皮特兰猪、约克夏猪；牛选取利木赞牛、普通牛、西门塔尔牛、夏洛莱牛；羊选取家羊、家山羊、内蒙古白绒山羊；鸡选取家鸡、白来航鸡、白洛克鸡、乌骨鸡；鸭选取北京鸭、建昌鸭、绍兴鸭；鱼选取鲫鱼、鲤鱼、草鱼、鲢鱼、青鱼。
[0023]根据植物食用油的品种，所述内源植物品种以大豆、花生、玉米、油菜、芝麻、橄榄、葵花子、山茶等为主。
[0024]利用NCBI对上述外源动物的线粒体DNA序列和内源植物叶绿体DNA序列进行查找，利用B1edit软件对查找到的DNA序列进行比对，分别筛选出外源动物线粒体的共同DNA序列和内源植物叶绿体的共同DNA序列，分别通过BLAST对筛选出的DNA序列进行保守性及特异性的验证；利用上述步骤筛选出的外源动物线粒体共同序列为SEQ ID N0.1，筛选出的内源植物叶绿体共同序列为SEQ ID N0.2。
[0025]使用引物设计软件Primer Premier 5在上述序列区分别进行外源动物通用引物和内源植物通用引物的设计，并分别通过BLAST对筛选出的通用引物进行保守性及特异性的验证，获得上述动物序列扩增引物序列(SEQ ID N0.3-4)，获得上述植物序列扩增引物序列(SEQ ID N0.5-6)。
[0026]在本发明的启示下，本技术领域的技术人员完全可以采用现有的软件，通过常规参数的选择来设计动物特有的特异性引物，并从中筛选出合适的引物与探针。
[0027]有益效果:
[0028]本发明所述的一种利用外源动物特征线粒体DNA检测进行地沟油检测的方法，检测灵敏、快速，将待检测油中含有的内源植物保守DNA序列作为质控线，以终浓度为10 17M的动物组织DNA标准品Ct值为检测限，消除了地沟油检测方法中利用绝对Ct值进行结果衡量的缺陷，避免了鉴定过程中人为操作、试剂、环境等对扩增效率影响(Ct值波动)。
【附图说明】
[0029]图1为动物引物特异性验证结果图
[0030]图2为植物引物特异性验证结果图
[0031]图3为地沟油检测限结果图
[0032]图4为疑似样检测结果图
【具体实施方式】
[0033]以下结合【具体实施方式】来详细说明本发明。
[0034]实施例1外源动物保守序列及内源植物保守序列的查找
[0035]通过NCBI对各个动物物种线粒体序列进行查找，利用序列比对软件B1edit进行序列比对，筛选出外源动物线粒体共同DNA序列，然后通过BlAST对筛选出的DNA序列进行保守型及特异性验证，最终目的区域序列为(SEQ ID N0.1)
[0036]GGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTGATGGTG