、10X反应缓冲液 2. 5yL、dNTPmix(2. 5mmol/L)2]iL、灭菌水 8]iL。
[0032] 42°C水浴Imin后，向反应体系中加入1yL(200U)SuperScriptTMIIRT，轻轻混 合，42°C保温50min;70°C水浴15min，终止反应，获得cDNA第一链。
[003引设计引物进行PCR扩增，引物序列如下：
[0034] PG12-F;5' -AGTACATTATTCTTGCCAACG-3';
[0035] PG12-R;5< -CTGTTCTCAAGTAATTTTAGTTTATTTC-3'。
[0036] PCR扩增条件为；94°C3min;然后 94°C30s，55°C30s，72°C2min，30 个循环；最后 72°ClOmirio
[0037] PCR扩增出约ll"bp大小的片段，回收后连接到pGEM-TEasy载体上，构建重组 质粒，并转化大肠杆菌D册a，提取酶切鉴定正确的阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表 明，克隆得到的cDNA序列如SeqIDNo. 2所示。其中，第34-1089bp为编码区，编码SeqID No. 1所示的PG12蛋白。
[003引 实施例2重组表达载体pPICZaB-PG12-His的构建
[0039] 酵母表达载体的构建：
[0040] W绿盲赔唾液腺cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增，引物序列如下：
[0041] F;5' -GAAGCTGCAGGAATTGCCGATATCAATAACCTGGA-3';
[0042] R;5' -CGGCTGGGCCACGTGACAGTCAACTTTGAGCCCGT-3'。
[0043] PCR扩增出的片段，回收后连接到pMD-TEasy载体上，构建重组质粒并转化大肠 杆菌D册a，提取酶切鉴定正确的阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，扩增产物大小 为105化P，其序列为SeqIDNo. 2中第34-1089bp的编码区序列。
[0044] ?0?扩增产物插入9?1〔2(16(11^1付〇旨611)的￡(3〇1?1位点，获得重组表达载体 pPICZaB-PG12-His。
[0045] 实施例3酵母转化及PG12蛋白的诱导表达
[0046] 将pPICZaB-PG12-His转化入毕赤酵母X-33中，挑取单克隆，于BM細培养基中在 28-3(TC条件下250 - 300巧m，培养至ODe。。= 2 - 6。室温1500 - 3000g离必5分钟收集菌 液，使用100 - 200mlBMMH培养基悬浮菌体至ODe。。= 1. 0,在28-30°C条件下250 - 300巧m 进行诱导表达。每24h加入总体积0. 5%的甲醇。诱导3-5d后，室温1500 - 3000g离必5 分钟收集上清。上清液使用带HiS标签蛋白纯化柱进行目的蛋白的纯化。
[0047] 所述BMGH培养基的配制方法为；10g酵母提取物，20g蛋白腺溶解于700ml去离 子水中，灭菌后加入lOOmllM磯酸盐缓冲液（132mllM馬册〇4和868mllMKH2PO4混合，pH= 6. 0)，100ml10XYNB(134gYNB溶解于 1000ml去离子水中），2ml500XB(20mg生物素溶解于 100ml去离子水中），100ml10XGY(100ml甘油与900ml去离子水混合），定容至1000ml。
[0048] 所述BMMH培养基的配制方法为；10g酵母提取物，20g蛋白腺溶解于700ml去离 子水中，灭菌后加入lOOmllM磯酸盐缓冲液（132mllM馬册〇4和868mllMKH2PO4混合，pH= 6. 0)，100ml10XYNB(134gYNB溶解于 1000ml去离子水中），2ml500XB(20mg生物素溶解于 100ml去离子水中），lOOmllOXM巧ml甲醇与95ml去离子水混合），定容至1000ml。
[0049] 实施例4PG12蛋白活性测定及生物测定
[0050] 使用平板测定法。首先在100ml磯酸钟溶液中（50mM，pH= 5. 5)加入1. 0% (m/ V)的琼脂糖和0.1% (m/v)的果胶。加热溶解后倒入培养皿中，待凝固后在其上打上小孔， 每个小孔加入5微升纯化后的PG12蛋白溶液，设置阴性对照，阴性对照为酵母菌株X-33发 酵24h后菌液上清。37C保温比，使用0.1%钉红溶液染色。可见琼脂凝胶小孔周围形成 透明圈，证明表达纯化的PG12蛋白具有果胶酶外切活性（图1)。
[005。 生物测定：向棉花叶片注射PG12蛋白溶液，地后注射孔周围出现晕斑。
[0052] 在棉花活体植株的顶尖、幼蕾和叶片注射纯化后的PG12蛋白溶液，3d后顶尖出现 孔洞，幼蕾脱落，叶片注射孔周围出现坏死（图2)。
[0053] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，送对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的送些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 绿盲蝽唾液蛋白PG12在降解果胶中的应用，PG12蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.I 所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 绿盲蝽唾液蛋白PG12在降解植物细胞壁中的应用，PG12蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基 酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，绿盲蝽唾液蛋白PG12的制备方法包 括以下步骤： 1) 绿盲蝽唾液蛋白PG12基因的克隆：分离绿盲蝽唾液腺，提取总RNA，反转录获得 cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物大小为1056bp;回收 PCR扩增产物连接到pMD-TEasy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5a，提取酶切鉴 定正确的阳性克隆的质粒进行测序； 2) 重组表达载体的构建：将PCR扩增产物插入pPICZaB载体的EcoRI位点，获得重组 表达载体pPICZaB-PG12-His; 3) 酵母转化及PG12的诱导表达：将pPICZaB-PG12-His转化入毕赤酵母X-33中，挑 取单克隆进行培养，培养过程中加入甲醇诱导表达PG12蛋白，培养结束后，离心收集上清， 用带His标签蛋白纯化柱进行PG12蛋白的纯化。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述引物为： F:5, -GAAGCTGCAGGAATTGCCGATATCAATAACCTGGA-3,; R# -CGGCTGGGCCACGTGACAGTCAACTTTGAGCCCGT-3，。5. 绿盲蝽唾液蛋白PG12或其编码基因在植物抗绿盲蝽唾液腺鉴定技术中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于棉花。
【专利摘要】本发明提供绿盲蝽唾液蛋白PG12的应用，PG12蛋白是由绿盲蝽唾液腺分泌的一种具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白。利用真核表达系统(例如酵母细胞)诱导表达的PG12蛋白可降解果胶、植物细胞壁，解决了难于从绿盲蝽体内直接分离获得PG12蛋白的问题。
【IPC分类】C12N15/56, C12R1/84, C12N15/81, C12Q1/34, C12Q1/68, C12N9/26, C12N1/19
【公开号】CN105200025
【申请号】CN201410277481
【发明人】张帅, 崔金杰, 王春义, 雒珺瑜, 吕丽敏, 李春花
【申请人】中国农业科学院棉花研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年6月19日