萤火虫荧光素酶热稳定性改造的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，涉及采用基因工程的方法提高酶热稳定性的方法，特别涉及利萤火虫荧光素酶热稳定性改造用的方法。
【背景技术】
[0002]荧光素酶(firefly luciferase, LUC )是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。萤火虫荧光素酶是一种能将化学能转化为光能的高效生物催化剂。早在1884年，Dubois发现将萤火虫研磨后荧光很快会消失，添加萤火虫尾部的新鲜提取物后又能重现荧光。此后，他证实提取物中存在荧光素和荧光素酶的相互作用，并指出在有氧分子、ATP的条件下，虫光素酶可催化荧光素氧化并发出便于灵敏检测的荧光。其化学反应如下:
荧光素+ ATP + O2 =氧化荧光素+ AMP + PPi + CO2 +光在有过量酶和过量底物存在的条件下，发光强度与反应中存在的ATP量成正比。这种发光特性使得萤火虫荧光素酶在各种测定ATP的研究和生产中广泛使用，目前，萤火虫荧光素酶已被用作生物传感器，开发成ATP快速检测试剂盒，用于快速检测血液、奶粉、食品生产线、医疗环境等样本中污染的细菌细胞。目前市场上所售的荧光素酶多从萤火虫尾部提取，易受到地域和季节的限制，且繁殖周期长，养殖成本高，分离纯化复杂。利用基因工程菌发酵生产荧光素酶具有周期短、不受季节、地域影响、成本低、过程易于规范控制等诸多优点，受到了人们的广泛关注。早在1985年，JefTery等人首次克隆了萤火虫荧光素酶基因，并构建了含虫光素酶基因的重组载体pkwlOI，在方.cWi中成功实现表达，获得了具有活性的荧光素酶。1993年，Lu等人构建了一株可高效分泌荧光素酶的大肠杆菌，从而使得基因工程菌规模化生产荧光素酶成为可能。目前，Promega, Sigma以及沈阳中科靓马公司已相继推出来自于大肠杆菌基因工程菌的荧光素酶。但与来自于萤火虫的荧光素酶相比，利用基因工程的方法生产的荧光素酶存在热稳定性较差等缺陷，严重制约了荧光素酶的应用。
[0003]本发明利用基因工程的方法对萤火虫荧光素酶进行改造，通过N、C末端融合表达label 1、label2，基于label 1、label2共价结合的特性，改变荧光素酶的现有结构，以提高萤火虫荧光素酶的热稳定性。
【发明内容】
[0004]本发明的技术目的之一在于提供一种基因工程的方法，从而解决酶稳定性差的缺陷；
本发明的另一技术目的在于提供一种基因序列，该序列可通过表达载体转入工程菌中，从而表达生成萤火虫荧光素酶，该萤火虫荧光素酶粗酶液热稳定性可明显提高，从而解决萤火虫荧光素酶热稳定性差的缺陷。
[0005]进一步的，为了达到本发明的目的，本发明的技术方案为: 一种提高酶热稳定性的方法，包括在现有基因的N端至少连接如Iable I所述的序列，且在同一基因的C端至少连接如Iable 2所述的序列，其中，label 1、label2能够共价结合，Iable I 与 Iable 2 的序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
[0006]一种能够表达合成萤火虫荧光素酶的多核甘酸序列，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0007]本方案中包含了上述核苷酸序列的重组表达载体。
[0008]在一个优选的载体T-1abel 1-1 inker-f1-1inker-1abel 2中，可采用如下步骤构建获得:
(1)以IabeII基因为模板，设计引物I和引物2，通过PCR的方法获得C端连有I inker的 label I 的 PCR 产物，命名为 label 1-1inker ；
(2)以荧光素酶基因fl为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法，获得N端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为I inker-f I ;
(3)步骤(1)、(2)获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、4进行PCR获得label1-linker-fl，胶回收 PCR 产物；
(4)以荧光素酶fl基因为模板，设计引物5和引物6，通过PCR的方法获得C端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为f1-1inker ;
(5)以label2为模板，设计引物7和引物8，通过PCR的方法，获得N端连有linker的 label 2 的 PCR 产物，命名为 Iinker-1abel 2 ；
(6)步骤(4)、(5)获得的PCR产物混合，作为模板，以引物5、8进行PCR获得fl-linker-label 2，胶回收 PCR 产物;
(7)步骤(3)、(6)获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、8进行PCR获得label1-1 inker-f 1-linker-labe I 2，胶回收 PCR 产物；连接 PMD19-T Vector，得到重组载体T-1abel 1-1inker-f1-1inker-1abel 2。
[0009]其中，上述各步骤引物序列:
引物 I 序列:GGAATTCCATATGCTTATCAGTTAGTACATGGAAAG，
引物 2 序列:AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGAATCTTTGCCG ；
引物 3 序列:CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAATTATGGAAGACGC ；
引物 4 序列:CAATTTGGACTTGCCGCCTTTTTTA ；
引物 5 序列:ATGGAAGACGCCAAAAATATCAAA，
引物 6 序列:AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGCAAITTGGACTTG ；
引物 7 序列:CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAAT，
引物 8 序列:CCGCTCGAGGTTTGGTTGTATGATCCTAG。
[0010]本发明还提供了含有上述重组表达载体T-1abel 1-1 inker-f1-1inker-1abel 2的大肠杆菌工程菌。
[0011]通过现有的发酵方法，可以在发酵培养基中发酵上述大肠杆菌工程菌以获得含有萤火虫荧光素酶的粗酶液。
[0012]利用该粗酶液，可以在不超过60°C的温度下，催化荧光素反应产生荧光。
[0013]其中，上述发酵培养的培养基为:大豆蛋白胨10~12 g/L，葡萄糖10~20 g/L，Na2HPO4 4-6 g/L, K2HPO4 1-3 g/L, NH4Cl 0.5~1 g/L, NaCl 0.1-0.5 g/L, MgSO4.7H20
0.1-0.5 g/L, AMP，luL/MLo
【附图说明】
[0014]图1 label 1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 构建过程。
[0015]图 2 pET22b_label 1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 构建过程。
[0016]图3 pET22b_label 1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 质粒酶切电泳图。
[0017]图4改造前后荧光素酶SDS-PAGE图；
其中，WT:未改造的焚光素酶；label l_fl_lable 2:在焚光素酶C端、N端添加lableK Iable 2 标签；label l-fl-lable -mutant 在焚光素酶 C 端、N 端添加 lable K Iable 2突变后的标签，使得Iable K Iable 2无法发生共价结合。
[0018]图5改造前后的萤火虫荧光素酶热稳定性比较。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
[0020]实施例1萤火虫荧光素酶基因重组载体pET22b_label1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 的构建过程
label 1-1 inker-f 1-1 inker-label 2构建过程的示意图如图1所示，具体的步骤为:
(I)以IabeI I基因为模板，设计引物I和引物2，通过PCR的方法获得C端连有I inker的 label I 的 PCR 产物，命名为 Iabel-1inker ；
PCR体系为:2XTaq Plus master mix (Taq酶预混合溶液)12.5 uL，模板DNA 2 uL，引物 I I uL，引物 2 I uL，ddH20 8.5 uL。PCR 反应进程为:I) 95°C预变性 5 min ；2) 94°C预变性30 s;3)55°C退火30 s;4)72°C延伸1.5 min ;步骤2)-4)重复29个循环；5) 72°C继续延伸30 s，冷却至4°C。胶回收PCR产物。
[0021](2)以荧光素酶基因fl为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法(退火时间按1000 bp/min设计，其余同上)，获得N端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为 I inker-f I ；
(3)步骤(1)、(2)获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、4进行PCR获得label1-linke