移 阳181] 1.材料方法 阳182] 1. 1细胞培养与转染
[0183]EBV阴性的鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中屯、，细 胞培养所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的膜蛋白酶均为美国G化C0公司 广品。
[0184] BART6-化由Invitrogen公司通过化学合成法合成，序列为： 阳化引CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA
[0186] 将生长状态良好的肿瘤细胞系按2X1〇5个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置 于37°C，5%C〇2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始BART6-化的转染；转 染过程如下：
[0187] 在无菌EP管中加入8y1的Hiperfect转染试剂（Qiagen公司产品）于100y1 无血清培养基中混匀静置5min;
[0188] 将BART6-化加入100y1无血清培养基中；然后与上述包含化pe计ect转染试剂 100y1无血清培养基溫和混匀，室溫静置30分钟，使它们形成复合体；
[0189] 用D-Hank'S液洗涂细胞3次；
[0190] 将上述混合物中加入800y1无血清培养基（无抗生素），溫和混匀后加入6孔板 中的1个孔； 阳191] 将6孔板置于C〇2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续 培养48小时。
[0192] 1. 2实时定量PCR检测BART6-化表达的效果：
[0193] 细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时巧光定量PCR法检测BART6-化的表达， 方法和步骤同实施例1。
[0194] 1.3细胞增殖实验
[01巧]MTT实验[3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2. 5-dipheny-tetrazoliumbromide assay]是检测肿瘤细胞增殖的常用手段，具体实验步骤如下： 阳196] 1)将细胞消化，计数，每孔接种500个细胞于96孔板中，每天需要设置5个复孔最 后求平均值，一共设置5天；
[0197] 2)放置培养箱培养至少5小时，待细胞贴壁后，加M1T液巧mg/ml) 20y1。继续培 养4小时，弃去培养液。每孔加入200y1DMS0,摇床上放置10分钟；
[0198] 3)选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上，测定各孔吸光度值并记录结果，此后每 隔24小时重复步骤2,记录一次数值，共计检测5天；
[0199] 4)实验重复S次。W各时间点为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制MTT曲线。 阳200] 1. 4细胞划痕实验 阳201] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迁移能力的实验方法。转染了BART6-化或对照 (scramble)序列的鼻咽癌或胃癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%时，用200ul pipet在每个6孔板中划一条直线（划痕），随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各个时间 点（视不同细胞迁移能力而定）在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细胞迁移 速度。 阳202] 1. 5细胞穿膜实验 阳203] 细胞穿膜（(transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8ym)及基质胶（Matrigel)购自美国抓公司，4%多聚甲醒固定液、结晶紫染液 (0. 1%g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按抓公司说明书进行基质胶膜水 化。 阳204] 在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1X105个转染了BART6-化或对 照（scramble)序列的鼻咽癌或胃癌细胞，在Transwell小室下层加入含20%胎牛血清的培 养基。细胞继续培养36小时后，用4%多聚甲醒固定液固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉 上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的肿瘤细胞。 阳205] 2.结果 阳206] 2. 1转染BART6-化后，肿瘤细胞中BART6-化的表达水平显著升高 阳207] 在邸V阴性的鼻咽癌细胞5-8F、H肥2,胃癌细胞AGS中转染BART6-化后，BART6-化 在鼻咽癌和胃癌细胞中的表达均显著升高（图8)，表明BART6-化转染成功。 阳20引 2. 2转染BART6-化后肿瘤细胞增殖速度减慢 阳209] M1T细胞增殖实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞系AGS中转入 BART6-化后，3株肿瘤细胞的生长增殖速度均明显减慢（图9)。
[0210] 2. 3转染BART6-化后细胞迁移能力减弱 阳21U 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入BART6-化 后3株肿瘤细胞从划痕两边往划痕中央迁移的速度减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞 运动迁移能力降低（图10)。
[0212] 2. 4转染BART6-化后细胞侵袭能力降低 阳21引细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中 转入BART6-化后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力减弱（图 11)。
[0214] 实施例4,过表达BART6-化抑制肿瘤细胞中IncRNA基因L0C553103的表达 阳21引 1.材料方法 阳216] 1. 1细胞培养与转染
[0217]EBV阴性的鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中心细 胞培养所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的膜蛋白酶均为美国G化CO公司 广品。
[0218] BART6-化由Invitrogen公司通过化学合成法合成，序列为：
[0219] CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA
[0220] 在肿瘤细胞中转染BART6-化的方法和步骤同实施例3。 阳22U 1. 2实时定量PCR检测转染BART6-化后IncRNA基因L(X553103的表达： 阳222] 细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时巧光定量PCR法检测IncRNA基因 L0C553103的表达，方法和步骤同实施例1，所用引物序列如下： 阳223] 用于实时巧光定量检测L0C553103表达的引物序列：
[0224]LOC553l〇3 正向引物：5，-acagtagtgcgatcaaggct-3， 阳2巧]LOC553l〇3 反向引物：5, -tcaccacctccctgttcttc-3， 阳226] 内参基因GAPDH特异性PCR引物：
[0227]正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 阳22引反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。 阳229] 2.结果
[0230] 转染BART6-化后，肿瘤细胞中L0C553013的表达水平显著降低 阳23U 在邸V阴性的鼻咽癌细胞5-8F、H肥2,胃癌细胞AGS中转染BART6-化后，IncRNA 基因L(X553103的表达均显著降低（图12)，表明BART6-化可抑制L(X553010的表达，或者 说IncRNA基因L0C553103是BART6-化的祀基因。
[0232] 实施例5，RNA干扰法抑制肿瘤细胞中L0C553103的表达可W抑制肿瘤细胞的生长 增殖及侵袭转移阳23引 1.材料方法
[0234] 1. 1细胞培养与转染
[0235] 鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中心细胞培养所用 RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的膜蛋白酶均为美国G化CO公司产品。
[0236] 特异性针对L0巧53103的RNA干扰序列（siRNA)如下： 。扣7] siRNA-1 :5, -AUAACAUGACAGCUUGCUUGUCUCC-3, 阳238] siRNA-2 :5' -CUUCCAAGCUCACUCAAGGUUGUUG-3， siRNA-3 :5' -CUAAUAUUCCCUCAGAGCUGGGCUG-3,
[0240] 上述特异性针对L0巧53103的RNA干扰序列由Invitrogen公司合成，阴性对照 (NC，scramble)序列也由Invitrogen公司合成并提供。 阳241] 细胞转染的方法和步骤同实施例3. 阳242] 1. 2RNA干扰L0C553103的表达后，通过细胞增殖实验、细胞穿膜实验和细胞划痕 实验检测了人为下调L0巧53103表达后细胞的生长、增殖、侵袭和转移能力的变化。具体方 法和步骤同实施例3. 阳2创 2.结果 阳244] 2. 1转染特异性针对L0C553103的RNA干扰序列后，肿瘤细胞中L0C553103的表 达水平显著降低
[0245]在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS中转染特异性针对L0巧53103的RNA干扰 序列后，L0C553103在上述细胞中的表达均显著降低（图13)，表明针对L0巧53103的RNA 干扰序列转染成功，抑制L0巧53103表达的效果明显。 阳246] 2. 2干扰L0巧53103表达后肿瘤细胞增殖速度减慢 阳247] M1T细胞增殖实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞系AGS中转入特异 性针对L0巧53103的RNA干扰序列后，3株肿瘤细胞的生长增殖速度均明显减慢（图14)。
[0248] 2. 3干扰L0巧53103表达后细胞迁移能力减弱
[0249] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入特异性针 对L0巧53103的RNA干扰序列后鼻咽癌和胃癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移的速度减 慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低（图15)。 阳巧0] 2. 4干扰L0巧53103表达后细胞侵袭能力降低 阳巧U 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中 转入特异性针对L0巧53103的RNA干扰序列后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少， 表明细胞侵袭能力减弱（图16)。 阳巧2] 实施例6,在动物模型中进一步证实过表达BART6-化或用RNA干扰法抑制肿瘤细 胞中L0巧53103的表达可W抑制肿瘤细胞的生长增殖及侵袭转移 阳巧引 1.材料方法
[0254] 1. 1细胞培养与转染
[0255] 鼻咽癌细胞系5-8F购自中南大学细胞中心细胞培养所用RPMI1640培基和胎牛 血清，及消化细胞所用的膜蛋白酶均为美国G化CO公司产品。 阳巧6] 在5-8F细胞中过表达BART6-化的方法同实施例3 ; 阳巧7] 在5-8F细胞中转染特异性针对L0巧53103的RNA干扰序列W抑制细胞内 L0C553103表达的方法同实施例5。 阳巧引 1. 2裸鼠"尾静脉注射-肺转移"模型检测BART6-化和L0巧53103的RNA干扰序 列对鼻咽癌细胞转移能力的抑制作用 阳巧9] 4周龄雄性裸鼠购自中南大学实验动物中屯、，分3组，每组10只，取对数生长期的 转染了BART6-化或RNA干扰序列W及Scramble序列（作为阴性对照，NC)的5-8F细胞 (如前一步所述），经膜酶消化后，在室溫（15~25°C)下，100化pm，离屯、分钟，弃去上清， 1XPBS洗涂2次，然后重悬细胞并计数。取3. 5X106细胞/只，经尾静脉注射到裸鼠体内。 继续常规饲养40天，处死裸鼠，观察裸鼠肺脏中转移瘤的大小和分布情况。 阳260] 1. 3裸鼠皮下移植瘤模型检测BART6-化和L0C553103的RNA干扰序列对鼻咽癌 细胞增殖能力的抑制作用 阳261] 4周龄雄性裸鼠购自中南大学实验动物中心分3组，每组4只，取对数生长期的 转染了BART6-化或RNA干扰序列W及Scramble序列（作为阴性对照，NC)的5-8F细胞 (如前一步所述），经膜酶消化后，在室溫（15~25°C)下，100化pm，离屯、分钟，弃去上清， 1XPBS洗涂2次，然后重悬细胞并计数。取3. 5X106细胞/只，接种于裸鼠右侧蔽部皮下。 每天按时观察接种肿瘤细胞后裸鼠的一般情况和精神状态，称体重，记录移植瘤形成的时 间及大小。用游标卡尺测移植瘤长（length,L)、宽（width,W)和高化ei曲t,H)，计算肿瘤 体积（V)，V= 4 3i/3*(L/2*W/2*H/2)。根据肿瘤大小绘制移植瘤生长曲线