生产除草剂-抗性甜菜植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产对除草剂（例如乙酰轻酸合成酶（ALS，acetohydroxyacid synthase enzyme)的抑制剂）有抗性的甜菜（糖用甜菜，sugar beet)植物的方法。
[0002] 本发明进一步涉及通过该方法获得的植物。
【背景技术】
[0003] 甜菜在温带和亚热带地区是一种重要的农业作物。
[0004] 在现代农业中，除草剂被广泛地用于管理杂草增殖。
[0005] 通过使用转基因方法可以进行对一种或多种除草剂（如ALS抑制剂）有抗性的甜 菜植物的生产（开发，develop)。
[0006] 实际上，在各种大田作物中，包括在甜菜中，已经成功地完成了外源DNA的引入， 该外源DNA携带赋予对除草剂的抗性的基因。
[0007] W095/10178公开了一种转基因诱导的对除草剂双丙氨膦（bialaphos)的抗性。 在甜菜的保卫细胞原生质体中引入编码该抗性的基因，随后将这些原生质体再生为甜菜植 物。那些植物进一步对化学草胺膦和其衍生物草铵膦有抗性。
[0008] 未转化植物无法获取对双丙氨膦的抗性。
[0009] 最佳地，83000原生质体再生成28个转化的愈伤组织（calli);最差地，190000原 生质体再生成1个愈伤组织。随后，这些愈伤组织中的一些可以示出体细胞胚胎发生（体 胚发生，somatic embryogenesis)并且可以再生成甜菜苗，具有1%的效率，而发现非常有 利的特征是尚达30 %。
[0010] 然而这种方法在本领域中并不常用，该方法广泛依赖于外植体的愈伤组织的更直 接转化，该外植体获得自甜菜器官（如胚（胚芽，embryo))和/或叶盘。
[0011] 对于开发抗除草剂植物（如在甜菜作物中）依然存在重要的需要，并且其不依赖 于DNA载体和/或外源基因的插入。
[0012] 另一方面，通过经典育种，利用将含有天然存在的抗性基因的甜菜植物在理论上 可以进行对一种或多种除草剂（如ALS抑制剂）有抗性的甜菜植物的开发。然而，这样的方 法是费时的，并且就申请人掌握的知识，该方法没有导致成功，尽管事实上至少对于除了甜 菜以外的物种（包括各种杂草物种），记载了天然存在的ALS抑制剂-抗性植物。特别地， 双重突变体（即，在相同的ALS基因中具有两个突变的植物）在自然界非常不可能产生。
[0013] 专利申请W098/02527公开了一种制备对一些ALS抑制剂（如磺酰脲除草剂）有 抗性的甜菜植物的方法，该方法包括以下步骤：将从甜菜（B. vulgaris)的外植体中获得的 愈伤组织暴露于磺酰脲，并且从少数的自发突变体再生植物，该突变体可以在这种除草剂 存在下生长。
[0014] 这种方法产生在ALS基因中具有突变的植物，其中，编码的ALS酶的位置188 (对 应于拟南芥（Arabidopsis thaliana)ALS酶的197位置）处的脯氨酸由丝氨酸取代（代 替）。然而，这种突变不是商业上使用的，因为利用优选的现代磺酰脲ALS除草剂（例如，甲 酰胺磺隆）的处理在田间试验中以必需剂量率表现出一些植物毒性。
[0015] 专利申请W02012/049268依赖于相同方法，不同之处在于从甜菜（B. vulgaris)的 外植体获得的愈伤组织暴露于甲酰胺磺隆，并因此导致甜菜植物对几种ALS抑制剂（包括 对甲酰胺磺隆）有抗性。
[0016] 这种方法产生在ALS基因中具有突变的植物，其中，编码的ALS酶的位置569 (对 应于拟南芥（Arabidopsis thaliana)ALS酶的574位置）处的色氨酸由亮氨酸取代。
[0017] 这种纯合子569/569突变体的田间试验示出了对甲酰胺磺隆、对碘甲磺隆（另一 种ALS抑制剂）、以及对不同ALS抑制剂的混合物表现出良好的抗性。
[0018] 这两种公开的方法受益于从单个外植体（如胚（embryo))中分离愈伤组织的广为 接受的步骤。然而，这是一种耗时的方法，其涉及（i)分离大量新鲜胚，（ii)将它们重复的 培养在琼脂凝固培养基上，以及（iii)使用形态选择方法选择可再生的愈伤组织。
[0019] 转移遗传性状至甜菜的其它策略已经得到发展并依靠叶肉原生质体（其不同于 气孔保卫细胞原生质体）作为起始材料（Krens et al·，1990, Theor. appl. Genet.，vol 79, 390-396)。
[0020] Gurel et al. 2008, Critical reviews in Plant Science, 27, 108-140,公开了甜 菜的生物技术应用。公开了7种不同的体外培养技术。其中有原生质体的培养，其或者来 自于气孔保卫细胞（用于转化目的）、或者来自于黄化下胚轴外植体的易碎愈伤组织（松散 愈伤组织），后者显著地更为有效。然而，使用原生质体的这种方法与主要的难点相关联。
[0021] Hall et al. 1997, J. Exp. Botany, 48, 255-263 已经使用 500000气孔保卫细胞原生 质体的培养物，用于利用外源DNA进行转化实验。转化效率高于2%。另一方面，植物的体 外培养被报道与气孔故障（stomatal failure)相关，指出相应细胞的问题，从而产生很高 量（如进行涉及突变事件的方法所需要的量）的气孔保卫细胞原生质体。
【发明内容】
[0022] 在广义方面，本发明公开了一种生产对除草剂有抗性的突变甜菜植物的方法，包 括以下步骤：
[0023] -从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞（stomatal guard cells)中获得原生质体 (protoplast)；
[0024] -向这些原生质体的体外培养物施加组合物，该组合物包含以下浓度的这种除草 剂，该浓度对于大于99%的体外培养细胞是致死的；以及
[0025] -从这些体外培养细胞中的存活细胞（surviving cells)再生甜菜植物，
[0026] -可能地选择在编码肽的基因中具有突变的再生甜菜植物，该肽由这种除草剂靶 向，
[0027] 其中，这些气孔保卫细胞原生质体针对它们再生为甜菜植物的能力加以预先选 择，并且其中，向大于20000000的这些原生质体施加这种除草剂。
[0028] 在本发明方法中使用的除草剂可以是不靶向ALS基因的除草剂。
[0029] 优选的除草剂（不靶向ALS)选自由以下各项组成的组：
[0030] -4-HPH)抑制剂（如甲基磺草酮、异噁唑草酮、磺酰吡唑醇、双环磺草酮、吡草酮、 吡唑特、苄草唑、环磺酮、苯唑草酮、磺草酮和sulcotrion)，类胡萝卜素生物合成抑制剂 (如呋草酮、氟啶草酮、氟咯草酮、氟丁酰草胺、氟草敏、氟吡酰草胺和吡氟草胺）；
[0031] -EPSP合酶抑制剂（如草甘膦或草甘膦三甲基硫盐）；
[0032] -光合体系（磷酸系统，phosphosystem) II抑制剂（如苯基-氨基甲酸酯类 (Phenyl-carbamate)(例如甜菜宁（杀敌草，phenmedipham)或甜菜安（desmedipham))、 t1 达嗪酮类（例如氯草敏（chloridazon)=杀草敏）、三嗪类（例如草净津（cyanazine)、 草达津（remtal)、甘草津（eglinazine-ethyl)、丙胺津（proglinazine-ethyl)、莠灭 净（ametryn)、莠去津（atrazine)、敌草净（atrazine)、异戊乙净（dimethametryn)、 扑灭通（prometon)、扑草净（prometryn)、扑灭津（propazine)、西玛津（simazine)、 西草净（simetryn)、甲氧去草净（terbumeton)、特丁津（terbuthylazine)、去草净 (terbutryn)、methoprotyn)、三嗪酮类（Triazinones)(例如苯嗪草酮（metamitron)、 嗪草酮（metribuzin)、环嗪酮（hexazinone)、嗪草酮）、脲喃啶类（除草定（bromacil)、 环草定、特草定）、脲类（噁挫隆（dimefuron)、异丙隆、利谷隆（Iinuron)、绿谷隆 (monolinuron)、横噻隆（ethidimuron)、甲基苯噻隆、丁挫隆（tebuthiuron)、敌草隆 (diuron)、非草隆（fenuron)、草不隆（neburon)、环草隆（siduron)、异隆（isouron)、氯 溴隆、绿麦隆（chlorotoluron)、枯草隆（chloroxuron)、伏草隆（fluometuron)、秀谷隆 (metobromuron)、甲氧隆（metoxuron)、噻氣隆（thiazafluron)、灭草隆（monuron)、环莠 隆（cycluron)、绿谷隆（monolinuron))、或氨挫草酮（amicarbazone)、蔬草灭（solan)、 敌稗（propanil)、灭草松（bentazon)、溴苯腈（bromoxynil)、碘苯腈（ioxynil)、杀草全 (bromofenoxim)、P达草特（pyridate)、氯苯P达醇（pyridafol);
[0033] -光合体系（磷酸系统，phosphosystem) I抑制剂（如敌草快（diquat)或百草枯 (paraqua))；
[0034] -细胞分裂抑制剂（如草长灭（carbetamide)、氯苯胺灵（chlorpropham)、苯胺 灵（propham)、萘丙胺（naproanilide)、草乃敌（diphenamid)、敌草胺（napropamide)、丁 稀草胺（butenachlor)、吡挫草胺（metazachlor)、乙酰甲草胺（diethatyl-ethyl)、乙草 胺（acetochlor)、甲草胺（alachlor)、丁草胺（butachlor)、毒草胺（Monsanto)、异丙草 胺（propisochlor)、二甲草胺（dimethachlor)、二甲吩草胺（dimethenamid)、异丙甲草 胺（metolachlor)、丙草胺（metolachlor)、S_ 异丙甲草胺、稀草胺（pethoxamid)、噻吩 草胺（thenylchlor)、莎稗磷（anilofos)、挫草胺（cafenstrole)、節草酮（indanofan)、 溴丁酰草胺（bromobutide)、哌草磷（piperophos)、氟噻草胺（flufenacet)、苯噻草胺 (mefenacet)、四挫酰草胺（fentrazamide));
[0035] -微管组装抑制剂（如炔苯酰草胺（propyzamide)=拿草特（pronamide)、牧 草胺（tebutam)、敌草索（chlorthal-dimethyl) =DCPA、氣消草（fluchloralin)、胺硝 草（pendimethalin)、地乐胺（butralin)、氟草胺（benefin)=氟草胺（benfluralin)、 乙丁稀氟灵（ethalfluralin)、氨磺乐灵（oryzalin)、氟乐灵（trifluralin)、氨氟乐灵 (prodiamine)、敌乐胺（dinitramine)、草胺磷（butamifos)、氟硫草定（dithiopyr)、噻草 定（thiazopyr))；
[0036] -原卟卩林原氧化酶抑制剂（如二苯醚类（三氟酸草醚钠（trifluralin)、甲羧 除草醚（bifenox)、氯氟草醚（ethoxyfen-ethyl)、草枯醚（chlornitrofen)、乙羧氟草 謎（fluoroglycofen-ethyl)、乙氧氣草謎（oxyfluorfen)、氯硝謎（chlomethoxyfen)、 三氟硝草醚（fluordifen)、氟黄胺草醚（fomesafen)、乳氟禾草灵（Iactofen)、除草醚 (nitrofen)、苯草謎（aclonifen))、N-苯基酿酰亚胺类（N-phenylphthalimides)(吲噪 酮草酯（cinidon-ethyl)、氟稀草酸（flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺（flumioxazin)、 氟稀草酸（flumiclorac-pentyl))、噁二挫类（丙炔恶草酮（oxadiargyl)、恶草酮 (oxadiazon))、噁挫焼二酮类（环戊噁草酮（pentoxazone))、苯吡挫类（异丙吡草酯 (fluazolate)、异丙吡草酯、氟挫草酯（pyraflufen-ethyl))、喃啶二酮类（苯喃磺草胺 (saflufenacil)、双苯喃草酮（benzfendizone)、氣丙喃