一种土壤重金属活化菌剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于重金属生物修复应用技术领域，具体设及一种重金属活化菌剂的制备 与应用。
【背景技术】
[0002] 我国的±壤重金属污染现状不容乐观，据中国科学院地理科学与资源研究所估 算，我国耕地重金属污染面积约1. 8亿亩。2013年12月底的国务院新闻办发布会上，国± 资源部介绍，我国被中度和重度污染的耕地面积大约是5000万亩。2014年4月17日，环境 保护部联合国±资源部发布了全国±地污染情况调查报告，在儒、隶、神、铜、铅、铭、锋、儀8 种重金属污染物中，儒污染居首位，其点位超标率达到7%。儒是耕地的首要污染物，是林 地、草地和未利用地的第二污染物。我国的Cd污染事件除发生在共、伴生Cd矿相对丰富及 采选冶活动较密集的云南、广东、湖南、贵州等地区外，还发生在城市近郊耕地、菜园±^及 引用工业污水灌概地区（卢红玲，2014)。相对于其他重金属，儒的生物活性更高，在±水系 统中有较高的迁移性，更容易被生物利用积累，不仅关系到农产品质量安全，还可通过食物 链危及动物和人类健康，因此寻找有效治理儒污染的方法是当前重要的课题。
[0003] 植物修复是国内外认为能够彻底清除±壤重金属污染的修复方法之一，±壤重金 属的活化能够促进±壤中的碳酸盐结合态（同时也包括憐酸盐态）、铁儘（侣）氧化物结合 态、有机物结合态、残渣态重金属转化为有效态重金属，大大增加±壤溶液中的有效态重金 属，从而大幅提高植物修复修复的效率。±壤微生物能通过代谢活动产生的有机酸、氨基酸 W及其它代谢产物溶解重金属及含重金属的矿物，真菌能影响菌根植物对重金属的积累和 分配，使菌根植物体内重金属积累量增加，提高植物提取的效果，向宿主植物传递营养，使 宿主植物抗逆性增强、生长加快，间接地促进植物对重金属的修复作用。。
[0004] 中国专利200710132243. 0提供了一种铅儒抗性细菌及其用于±壤重金属污染的 植物修复方法，所述的±壤重金属活化菌株为伯克霍尔德氏菌属，为无芽抱细菌，非芽抱菌 适应能力弱，有效活菌易死亡，同时将发酵液直接灌装或用草炭吸附制成的生物促进剂， 保质期较短，存在着应用效果稳定性低等问题。中国专利201310104049. 7提供了一种里氏 木霉联合伴矿景天在儒污染农田±壤修复中的应用，制剂施加量为供试±壤质量的4%，换 算成亩施用量为6000kg(-亩地耕层±壤质量约为150000kg)，用量大，成本较高。中国专 利201310196985. 5提供了一种东南景天内生菌及其应用，用于植物-微生物联合修复重金 属污染±壤，所述的内生菌具有氨节青霉素、四环素耐药性，施用具有耐药性的菌株容易造 成抗生素耐药基因的污染，具有潜在风险。许多重要的生化过程靠单种微生物是不能完成 或只能微弱进行，本发明利用微生物之间的协同作用，构建了一种具有重金属修复、病虫害 防治、促生增产=效合一的复合微生物活化菌剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种±壤重金属活化菌剂，其制备方法与应用。该菌剂通过 绿色木霉、尿素酶芽抱杆菌、胶冻样芽抱杆菌的代谢活动，促进±壤中的碳酸盐结合态儒 (同时也包括憐酸盐态儒）、铁儘（侣）氧化物结合态儒、有机物结合态儒、残渣态儒转化为 有效态儒，促进植物对儒的吸收，同时能够提高植物抗逆性，促进植物生长，抑制病虫害的 发生和改善±壤微生态。
[0006] 一种±壤重金属活化菌剂，其特征在于，它主要是由绿色木霉菌株、尿素酶芽抱 杆菌、胶东样芽抱杆菌组成，有效活菌数> 2亿/g。其中，运3种菌中，优选每种菌有效菌 > 0. 5亿/g。优选地，该菌剂有效活菌数> 2亿/g,水分《35%，抑值范围在5. 5~6. 3。 优选地，按质量百分比的组成为绿色木霉粉剂35 %~75 %、尿素酶芽抱杆菌粉剂20 %~ 60 %、胶冻样芽抱杆菌发酵液5 %~10 %。
[0007] ±壤重金属活化菌剂的制备方法如下：
[0008] 1)在PDA平板上分别活化绿色木霉，在营养琼脂培养基上活化尿素酶芽抱杆菌， 在ACCC55固氮培养基上活化胶冻样芽抱杆菌，将活化好的S株菌转接到相应的液体培养 基上制备种子液。
[0009] 绿色木霉（HypocreaVirens)为S炬-15菌株，保藏机构：中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中屯、，保藏地点，北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，保藏时间 2015年07月03日；保藏编号为CGMCCNo. 11042。
[0010] 尿素酶芽抱杆菌OJreibacillus suwonensis)为S炬-13号菌株，保藏机构：中国 典型培养物保藏中屯、，保藏地点：湖北省武汉市，武汉大学；保藏时间2015年5月18日； 保藏编号为CCTCCN0:M2015314。
[0011] 胶冻样芽抱杆菌度acillusmucilaginosus)为S炬Ol号菌株，保藏机构：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏地点，北京市朝阳区，中国科学院微生物研 究所，保藏时间2010年7月2日；保藏编号为CGMCCNo. 3995。
[0012] PDA培养基组成为：马铃馨200g/L、葡萄糖20g/l、琼脂20g/L，自然抑；营养琼脂 培养基组成为：蛋白腺lOg/L牛肉膏3g/L、氯化钢5g/L、琼脂20g/L，自然pH。ACCC55固氮 菌培养基组成为：薦糖 1 %、K2HPO4?抓2〇 0. 05 %、化Cl0. 02 %、CaC〇30. 1 %、M拆〇4? 7&0 0. 02%，琼脂 1.8%，pH7. 0 ~7. 2。
[0013] 2)绿色木霉、尿素酶芽抱杆菌分别WIOOmLAg的比例接种至固体发酵培养基中， 发酵7~lOd。胶冻样芽抱杆菌W5%~15%体积比的接种量接种至二级液态发酵培养基 中，发酵2~3d。
[0014] 所述的固态发酵培养基的组成为：教皮90%、豆巧粉5%、酵母粉4. 7%、憐酸二 氨钟0. 1%、屯水硫酸儀0. 1%、硫酸锭0.1%，加入培养料总质量50%的有机废水后混匀 12rc灭菌比。所述的胶冻样芽抱杆菌二级液态发酵培养基的组成为：淀粉0. 55%、酵 母膏0. 157 %、硫酸儀0. 14 %、憐酸氨二钟0. 2 %、碳酸巧0. 05 %、氯化钢0. 02 %，氯化铁 0. 0005%，其余为有机废水，pH7. 0~7. 2。所述的有机废水是指新鲜的豆腐废水、粉丝废 水、玉米淀粉废水、洋芋废水、海产品加工废水、味精废水、酒精废水的至少一种。
[0015] 3)所述的±壤重金属活化菌剂由绿色木霉粉剂、尿素酶芽抱杆菌粉剂、胶冻样芽 抱杆菌发酵液复配组成，按质量百分比的组成为绿色木霉粉剂35%~75%、尿素酶芽抱杆 菌粉剂20 %~60 %、胶冻样芽抱杆菌发酵液5 %~10 %。
[0016] ±壤重金属活化菌剂的有益效果：
[0017] I)重金属耐受特征：绿色木霉（=炬-15)、尿素酶芽抱杆菌（=炬-13)对多种重 金属具有耐受性，适应范围广，绿色木霉对CcT耐受浓度达到7840mg/l、化2+耐受浓度达到 6216mg/l、Cr6+耐受浓度达到1560mg/L、Ni2+耐受浓度达到2934. 5mg/L、Cu2+耐受浓度达到 320mg/L。尿素酶芽抱杆菌、胶冻样芽抱杆菌对CcT耐受浓度达到lOOmg/l、^2+耐受浓度 达到500mg/L。
[0018]2) ±壤重金属活化特征：绿色木霉、尿素酶芽抱杆菌、胶冻样芽抱杆菌对发酵液 中的CdC〇3的活化率与对照相比均超过100%，显著提高了植物提取修复率。
[0019] 所述的±壤重金属活化菌剂，其特征为：粉剂，有效活菌数> 2亿/g,水分《35%， pH值范围在5. 5~6. 3。本发明与现有技术相比，具有W下优点和效果：
[0020] 1)绿色木霉、尿素酶芽抱杆菌、胶冻样芽抱杆菌对于多种重金属具有较强的耐受 性，菌株活性强，菌株之间不括抗，适应范围广。
[0021] 2)本发明的±壤重金属活化菌剂能够活化±壤重金属，菌株代谢产酸，能够降低 ±壤抑，菌株协同作用显著提高±壤有效儒的含量，利用有机废水为发酵原料原料，进一步 增强了重金属的迁移活性。促进植物对重金属儒的吸收，提高植物修复效率。
[0022] 3)本发明的±壤重金属活化菌剂中的功能菌株能够提高植物抗逆性，促进植物生 长，抑制病虫害的发生和改善±壤肥力，是一种具有重金属修复、病虫害防治、促生增产= 效合一的复合微生物活化菌剂。
[0023] 4)本发明的±壤重金属活化菌剂制备简单，有效活菌为抱子和芽抱，具有有效活 菌数高、存储久、易运输、安全环保、无二次污染等优点。
【具体实施方式】
[0024] 下面实例将进一步说明本发明方法的可行性和应用效果 [00巧]实施例1、菌株活化发酵液中的不溶性重金属儒
[0026] 为了考察菌株的代谢活动对难溶CdC〇3的活化作用，在500血的摇瓶中装入IOOm