一种CIKs细胞和DC-CIKs细胞的培养体系的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞因子诱导的杀伤细胞（巧tokine-in化cedkillers,CIKs)技术领 域，具体地，涉及一种CIKs细胞的培养体系及DC-CIKs细胞共培养体系及其在制备在肿瘤 的细胞免疫治疗中药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 癌症问题日趋严峻，癌症的预防与控制面临巨大挑战。世界卫生组织国际癌症研 究中必认为，未来癌症发病人数年均将会W3%~5%的速度递增，预计2020年全球将有 2000万癌症新发病例，死亡病例将达1200万。从发病率来看，中低收入国家癌症发病率远 高于发达国家。目前我国癌症呈明显高发态势，城市中癌症已经占到死亡总数的25%，农 村为21%，已出现癌症乡和癌症村。癌症患者呈年轻化趋势。据《2012年中国肿瘤登记年 报》报告，我国肿瘤发病率和死亡率的概况为：每10万人有286人患癌，一生中有22%的 概率患癌症；每10万人有181人患癌死亡，一生中有13%的概率患癌死亡。男女肿瘤发 病率之比为1. 3 ;1，肿瘤死亡率之比为1. 65 ;1。肿瘤发病率随人群年龄逐渐上升，特别是 50岁W上随年龄增加而大幅上升，50岁W上占全部发病的80%W上，每年肿瘤死亡人数为 140-150 万。
[0003] 常规的肿瘤治疗手段，即手术、放疗和化疗，对于进展性的或晚期肿瘤仍然束手无 策。许多肿瘤患者最终死于肿瘤的转移和耐药。中科院曾益新院±领导的团队发现放化疗 可能导致基因组不稳定，肿瘤细胞转化成肿瘤干细胞（Cancerstemcells,CSCs),即产生 新的肿瘤"种子"，送可能是肿瘤放化疗后复发的一个重要机制。肿瘤治疗的目的是杀伤手 术不能完全切除的残留肿瘤，然而肿瘤细胞固有的特性和肿瘤微环境限制了已经成熟的或 正在研究中的治疗方案的疗效。肿瘤细胞来自于宿主，携带有宿主的特性，因此各种副作用 会限制治疗窗，难W获得对肿瘤有效的治疗效果。而且，由于肿瘤变异的特性，肿瘤对常规 放射和化学治疗有明显的反弹效应。例如，当细胞毒性化疗药物将大部分肿瘤细胞摧毁后， 少量对送种药物有抗性的细胞仍有能力成为新的肿瘤灶。更糟的是，送种肿瘤对先前有效 的治疗不再产生反应，因为肿瘤细胞在细胞毒性药物的选择压力下会产生抗性。即在正常 条件下存活而被选择出来的郝部分肿瘤细胞导致了肿瘤的复发和发展、转移。因为肿瘤细 胞具有一种重要的遗传可塑性，所W对任何致死性压力的抗性，都可W在肿瘤细胞群体中 被进化选择出来，送类似HIV的变异和细菌的耐药性。要成功地治疗肿瘤，可能需要多种针 对肿瘤细胞不同存活机制的祀向制剂。但是，与HIV比较，肿瘤细胞有更大的基因组，所W 肿瘤细胞演化中可利用的遗传空间远远大于HIV。现在证明有效地杀灭肿瘤是相当具有挑 战性的，因为肿瘤基因组能够在对药物的多种选择压力的反应中进化出存活机制，即使联 合使用药物时也是如此。肿瘤学领域中尽可能多地鉴别各种存活机制，并找到抑制送些机 制的方法。
[0004] 通常有两种解决方法；攻击肿瘤细胞本身改变成攻击维持肿瘤生长和存活的环 境，或者使免疫系统像对付感染郝样去杀伤肿瘤细胞。前一种策略，就其本质而言是被动 的，因为肿瘤细胞是被间接的途径所杀伤。例如，抗血管生长治疗阻断肿瘤的血液供应，从 而间接地杀伤肿瘤。送种治疗不容易诱导产生抗性，因为肿瘤环境中的基质细胞在基因上 相对稳定。然而，由于其被动型，送种治疗仍然因肿瘤细胞的演化而容易复发，例如抗血管 生长治疗中，血管又会再现，可能因为营养和低氧环境导致肿瘤干细胞的产生。与此相反， 一种主动的、更具吸引力的策略是，在肿瘤患者中"唤醒"主动免疫反应，使其参与抗肿瘤治 疗。送种策略的主要作用是规避肿瘤的异质性，而送种异质性是肿瘤细胞对选择压力反应 的结果。在送点上，免疫系统特别适合于清除少量残存的肿瘤细胞，尤其是郝种放疗和化疗 很难杀灭的静止期细胞或肿瘤干细胞，送有助于延长无瘤生存期。事实上，即使送种治疗 没有治愈肿瘤，而只是将肿瘤细胞逆转为类似于HIV感染郝样的亚临床状态，能让肿瘤在 能够逃脱激活的免疫系统的监控的情况下向免疫系统倾斜，使肿瘤生长进展缓慢或逆转消 退。
[0005]目前国内外非常关注免疫细胞治疗肿瘤。2010年FDA批准DC细胞疫苗治疗前 列腺癌具有里程碑意义，世界各国已有200多项治疗各种不同肿瘤的DC疫苗进入临床I、 II期。近年来除了DC细胞疫苗外，其他免疫细胞也用于肿瘤的细胞免疫治疗，主要有：细 胞因子诱导的杀伤细胞（巧tokine-imluced1^116'3，(：11(3)、肿瘤侵润淋己细胞灯比）、 自然杀伤细胞（化化ralkiller,NK)、Capri细胞（也称链式激活的CIK)和Y6T细胞 等，W及不同免疫细胞的组合，主要是DC细胞激活的效应细胞（如DC-CIK，DC-CTL)和多 种免疫细胞的联合治疗，W发挥送些免疫细胞不同的功能。送些免疫细胞已在临床上使 用，其中CIK应用较为广泛，DC-CIKs或CTL较单纯的效应细胞对肿瘤的治疗效果好，主要 由于DC和效应细胞CIKs和CD8+T之间的相互作用，增加了效应细胞对肿瘤的特异杀伤 和效应细胞的活化。但DC细胞和效应细胞的相互作用非常复杂，不仅存在MHC-I-表位 多肤复合物和T细胞受体（TCR)作用的第一信号（Signal-I)和共刺激分子和其受体之 间的作用的第二信号（signal-2)，W及细胞因子刺激的第H信号（signal-3)(图1)。效 应细胞激活后产生共抑制性信号，W减弱因效应细胞过度激活对机体产生的伤害，送种抑 制性受体被称为"免疫检查点（immunecheckpoint)"。主要有PD-I和共抑制性受体， 如CTLA-4,B和T淋己细胞减弱因子度andTLympho巧teAttenuator,BTLA或CD272)， Tim-3(TcellImmunoglobulinandMucindomain-3),LAG-3(LymphocyteActivation Gene-3)等。其中PD-l/PD-Ll信号途径是最重要的途径之一，大量证据表明PD-I是一个 共抑制受体，在活化的T细胞表达，负调节T细胞功能【DrewEPardoll.Theblockade ofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy.NATUREREVIEWS|CANCER. 2012, 12(2 53) : 252-264.】。例如，PD-I在抗原-激活的CD8巧细胞高水平表达和CD8巧细胞耗损灯 cellexhausion)相关。被耗损的CD8巧细胞渐渐失去效应功能，包括增殖能力、表达如 比-2、TNF-a和IFN-Y等细胞因子的能力，最终导致细胞调亡。耗损的PD-1+CD8巧细胞 在肿瘤的肿瘤侵润淋己细胞（tumor-infiltratingIympho巧tes，TILs)和慢性病毒性感染 得至Iji正明【BadouaC,HansS,MerillonN,etal.PD-1 -Expressin邑Tumor-In円Itratin邑 TCellsAreaFavorablePrognosticBiomarkerinHPV-AssociatedHeadandNeck Cancer.CancerRes. 2013 ;73 (I):128-138.PaiS.Adaptiveimmuneresistancein HPV-associatedheadandnecksquamouscellcarcinoma.Oncolmmunology. 2013 ； 2:5,e24065.SznolMandQienLAntagonistAntibodiestoPD-IandB7-H1 (PD-Ll) intheTreatmentofAdvancedHumanCancer.ClinCancerRes.2013 ； 19 (5):1021 -1034.BauzonMandHermistonT.Armedtherapeuticviruses-adisruptivetherapy onthehorizonofcancerimmunotherapy.FrontiersinImmunology. 2014 ；5:1-10. Lyford-PikeS,PengS,YoungG,etal.EvidenceforaroleofthePD-1:PD-L!