角膜缘干细胞的分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞培养领域，尤其设及角膜缘干细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002] 角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜鉴别的标志是Bowman氏膜的终止 处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞，宽约1mm，此处仅有上皮层和基质层，其上皮细胞 层超过10层，排列不规则，细胞呈小的圆柱状，核深染，其深部基底细胞为一层小圆柱状或 立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行.在基底部乳头形成，形成特殊的"栅栏"样上皮 结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。
[0003] 角膜缘干细胞是角膜缘细胞的一个亚群，具有独特的生物学特性：生存期长，分化 度低，细胞周期长，DNA合成期短，具有高度的分化和增殖潜能等。干细胞分裂产生两个子 细胞，一个保持母细胞表型，继续成为干细胞，另一个演化为具有细胞功能的上皮细胞。在 自身更新的组织内干细胞被认为是细胞谱系的起源，同时也是细胞增殖和分化的源泉。
[0004] 目前开展的角膜缘干细胞移植，包括自体或异体角膜缘组织移植和体外培养的角 膜缘干细胞移植。自体角膜缘组织移植，当取供眼角膜缘组织超过2/3周，可导致供眼角膜 缘干细胞缺陷，继而引起眼表病变。而且，如果当自体眼已处于亚临床状态时，取材后供眼 眼表病变则会加重，进而引起视力下降。此外，自体角膜缘组织移植不适合双眼角膜缘病变 的患者。异体角膜缘组织移植存在排斥反应。因此，采用体外培养的角膜缘干细胞移植联 合穿透性角膜移植治疗严重的角膜病变，近年来成为人们关注的热点。 阳0化]角膜缘干细胞的分化阶段大体上分为：角膜缘干细胞化imbalStemCells,LSCs。 在角膜缘基底部的最基层）一短暂扩充细胞CTranscientAmplifyingCell,TAC。在角膜 缘的基底部）一有丝分裂后细胞（PostMitoticCells，PMS。位于角膜上皮大多数非表面 的区域）一终末分化细胞（TerminallyDifferentiatedCell,TDC。上皮细胞主要位于角 膜的浅表）。现在普遍认为，角膜上皮细胞的更新是通过垂直向前的运动和水平向屯、的运动 的方式共同作用实现的，而角膜缘干细胞LSCs则成为其再生的最终源泉。
[0006] 对于角膜缘干细胞的原代获取，目前已有的分离方法主要有两种：（1)酶消化法。 用膜蛋白酶对用含双抗PBS漂洗干净并获取角膜缘组织进行消化，直至细胞分离出来，过 筛，离屯、并接种培养。（2)组织块贴壁法。分别用含双抗的PBS漂洗干净人角膜缘组织，目艮 科剪把角膜缘组织剪碎成2X2mm3组织块，用培养基接种于培养皿中进行培养。
[0007] 现有的角膜缘干细胞的原代分离方法中的酶消化法技术，虽然能在短时间内获得 数量较多的细胞，但是膜蛋白酶对细胞的贴壁产生影响，在后期分离过程中导致成纤维细 胞不易贴壁，使其混在为贴壁的角膜缘细胞中，降低了细胞的纯度。并且，成纤维细胞及其 分泌的产物可促进上皮细胞的增殖，刺激角膜缘干细胞向上皮细胞分化，降低了细胞的纯 度。
[0008] 因此，应当进一步开发分离效率高，所得细胞纯度高的角膜缘干细胞的分离方法。
【发明内容】
[0009] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供角膜缘干细胞的分离方法，本发明 提供的方法分离效率高，所得细胞纯度良好。
[0010] 本发明提供的角膜缘干细胞的分离方法，包括W下步骤：
[0011] 步骤1 :将胎儿角膜缘组织W复合酶酶解；
[0012] 步骤2 :将酶解后的产物W角膜缘干细胞分离培养基培养后，传代；
[0013] 复合酶包括中性蛋白酶和IV胶原酶；
[0014] 角膜缘干细胞分离培养基包括AcSDKP、胎牛血清和基础培养液。
[0015] 本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶 解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率。并且，采用本发明 提供的复合酶对角膜缘组织进行酶解，对成纤维细胞贴壁效果的影响较小，从而提高了所 得细胞的纯度。该方法仅酶解一次，避免了多次酶解多次离屯、对细胞造成的损伤。
[0016] 在本发明的实施例中，胎儿角膜缘干细胞取自死亡的胎儿。
[0017] 在本发明的实施例中，胎儿为兔、大鼠或人类胎儿。
[0018] 在一些实施例中，胎儿为人类胎儿。
[0019] 在一些实施例中，人类胎儿的胎龄为3个月~7个月。
[0020] 在本发明的实施例中，复合酶中中性蛋白酶和IV胶原酶的质量比为3:2~2:1。
[0021] 在一些实施例中，复合酶中中性蛋白酶和IV胶原酶的质量比为3:2。
[0022] 在本发明的实施例中，复合酶中中性蛋白酶的质量分数为0.75%~0.8% ;IV胶 原酶的质量分数为0. 4%~0. 5%。
[0023] 在一些实施例中，复合酶中中性蛋白酶的质量分数为0. 75% ;IV胶原酶的质量分 数为0.5%。
[0024] 在本发明的实施例中，复合酶与胎儿角膜缘组织的体积比为1:5。 阳0巧]在本发明的实施例中，复合酶酶解的溫度为37°C，时间为IOmin~20min。 阳0%] 在一些实施例中，复合酶酶解的时间为15min。
[0027] 在本发明的实施例中，复合酶WPBS配制，抑值为7. 2。 阳02引在一些实施例中，PBS溶液组分的含量为：NaCl7. 9g/L，KCl0. 2g/L，KH2PO4O. 24g/L和K2HPO4I.8g/L。
[0029] 在本发明的实施例中，复合酶酶解的终止液为含有FBS的PBS。
[0030] 在一些实施例中，复合酶酶解的终止液中FBS的体积分数为10%。
[0031] N-乙酷基-丝氨酷-天口冬酷-赖氨酷-脯氨酸（N-acet^-Seirl-aspart^-l ys^-proline，AcSDKP)是一种具有生理调控活性的四肤因子。早期研究发现，AcSDKP能 够抑制造血干细胞的增殖。近年来研究发现，AcSDKP具有类似血、管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI)的作用。在大鼠模型中，AcSDKP能够减轻高血压和屯、肌梗死后屯、脏的纤维化。
[0032] 本发明将其用于角膜缘干细胞的分离和培养，通过抑制角膜缘组织酶解后所得细 胞中成纤维细胞的生长，提高所得角膜缘干细胞的纯度，改善所得角膜缘干细胞的品质。
[0033] 本发明还提供了角膜缘干细胞分离培养基，包括AcSDKP、胎牛血清和基础培养液。
[0034] 在本发明的实施例中，本发明提供的角膜缘干细胞分离培养基中AcSDKP的质量 分数为0.01%~10%。
[0035] 在一些实施例中，本发明提供的角膜缘干细胞分离培养基中AcSDKP的质量分数 为 0. 5%~1%。
[0036] 在一些实施例中，本发明提供的角膜缘干细胞分离培养基中AcSDKP的质量分数 为 0. 5%。
[0037] 在本发明的实施例中，胎牛血清与基础培养液的体积比为（10~20) : (80~90)。 阳03引在一些实施例中，胎牛血清与基础培养液的体积比为10:90。
[0039] 在本发明的实施例中，基础培养液为DMEM液体培养基。
[0040] 本发明提供的培养基中，W胎牛血清促进角膜缘干细胞的生长，WAcSDKP抑制成 纤维细胞的生长。因此，采用本发明提供的培养基能够具有选择性的分离角膜缘干细胞，且 分离培养所得的角膜缘干细胞的纯度和数量皆较高，且由于成纤维细胞的生长受到抑制， 角膜缘干细胞受到成纤维细胞分泌物的影响较少，干性保持良好。
[0041] 在本发明的实施例中，步骤2所述培养的接种密度为1X1〇5个/ml。
[0042] 在本发明的实施例中，酶解的终止液为含有FBS的PBS。
[0043] 在一些实施例中，酶解的终止液中FBS的体积分数为10%。
[0044] 在一些实施例中，步骤2中所述培养的条件为5%C02、37°C、湿度95%。 W45] 在一些实施例中，步骤2中所述培养的时间为2地。
[0046] 在一些实施例中，步骤2中所述培养至细胞汇合度为80 %。
[0047] 在本发明的实施例中，传代具体为：W膜蛋白酶消化细胞后，队本发明提供的角膜 缘干细胞分离培养基培养。
[0048] 本发明提供了一种角膜缘干细胞的分离方法，本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶 组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对 细胞的损伤，增大细胞得率。并且，本发明采用的培养基W胎牛血清促进角膜缘干细胞的生 长，WAcSDKP抑制成纤维细胞的生长，能够选择性的分离角膜缘干细胞，且分离培养所得 的角膜缘干细胞的纯度和数量皆较高。而由于成纤维细胞的生长受到抑制，角膜缘干细胞 受到成纤维细胞分泌物的影响较少，干性保持良好。试验表明，采用本发明提供的培养基分 离角膜缘干细胞，每Icm3角膜缘组织能够获得8. 4X105个~9. 0X105个角膜缘干细胞，细 胞中抗体CX43的阳性率为0,AE5的阳性率为0. 1%，化加的阳性率为70. 1%，PCNA的阳 性率为82.1%。该效果显著优于现有技术。
【具体实施方式】
[0049] 本发明提供了角膜缘干细胞的分离方法，本领域技术人员可W借鉴本文内容，适 当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进 行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法和应用进行 改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0050] 本发明采用的试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0051] 下面结合实施例，进一步阐述本发明： 阳0巧 实施例1 阳05引复合酶液：WPBS配制，0. 75%中性蛋白酶+0. 50%IV胶原酶，pH7. 2
[0054] 培养基：90%DMEM培养基+10%FBS，其中AcSDKP的质量分数为0. 5%。 阳化5] 将胎龄为3~7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗（青霉素-链霉素， 1X)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。
[0056] 在手术显微镜下，用组织綴和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成 约ImfflS大小的块状。
[0057] 根据组织块的体积，每Icm3组织块加入5ml复合酶液，37°C消化15min，每I