ml消 化液加入含10%FBS的PBS中止消化，用IOOum网筛过滤，100化pm离屯、5min，弃除上清， 加入培养基，WIXl〇5cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37%°C，含5%C〇2培养箱中培 养。
[0058] 每个细胞培养皿底层汇合度至80%，去除培养皿上的上清培养液，加入膜蛋白 酶，消化5~lOmin，每Iml消化液加入含10%FBS的PBS中止消化，W加入培养基，W 1Xl〇5cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37%°C，含5%C〇2培养箱中传代培养。
[0059] 实施例2 W60] 复合酶液：WPBS配制，0.8%中性蛋白酶+0.4%IV胶原酶，pH7. 2
[0061] 培养基：90%DMEM培养基+10%FBS，其中AcSDKP的质量分数为0.8%。
[0062] 将胎龄为3~7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗（青霉素-链霉素， 1X)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。
[0063] 在手术显微镜下，用组织綴和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成 约ImfflS大小的块状。
[0064] 根据组织块的体积，每Icm3组织块加入5ml复合酶液，37°C消化lOmin，每Iml消 化液加入含10%FBS的PBS中止消化，用IOOum网筛过滤，100化pm离屯、5min，弃除上清，加 入培养基，WlXl〇5cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37%°C，含5%C02培养箱中培 养。 阳O化]每个细胞培养皿底层汇合度至80%，去除培养皿上的上清培养液，加入膜蛋白 酶，消化5~lOmin，每Iml消化液加入含10%FBS的PBS中止消化，W加入培养基，W 1Xl〇5cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37%°C，含5%C〇2培养箱中传代培养。
[0066] 实施例3
[0067] 复合酶液：WPBS配制，0.78%中性蛋白酶+0.45%IV胶原酶，pH7. 2
[0068] 培养基：90%DMEM培养基+10%FBS，其中AcSDKP的质量分数为1 %。
[0069] 将胎龄为3~7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗（青霉素-链霉素， 1X)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。
[0070] 在手术显微镜下，用组织綴和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成 约ImfflS大小的块状。
[0071] 根据组织块的体积，每Icm3组织块加入5ml复合酶液，37°C消化20min，每Iml消 化液加入含10%FBS的PBS中止消化，用IOOum网筛过滤，100化pm离屯、5min，弃除上清，加 入培养基，WlXl〇5cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37%°C，含5%C02培养箱中培 养。 阳072] 每个细胞培养皿底层汇合度至80% (约96h)，去除培养皿上的上清培养液，加入 膜蛋白酶，消化5~lOmin，每Iml消化液加入含10%FBS的PBS中止消化，W加入培养基， W I Xl〇5cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37% °C，含5%C〇2培养箱中传代培养。阳07引对比例1-3
[0074]培养基和消化酶的使用如表1: 阳07引表1 :对比例1-3
[0077] 将胎龄为3~7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗（青霉素-链霉素， 1X)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。
[0078] 在手术显微镜下，用组织綴和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成 约lmm3大小的块状。 阳0巧]根据组织块的体积，每Icm2组织块加入5ml消化液，37°C消化15min，每Iml消化 液加入含10%FBS的PBS中止消化，用IOOum网筛过滤，100化pm离屯、5min，弃除上清，加入 培养基，WlXl〇5cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37%°C，含5% %培养箱中培养。 [0080] 每个细胞培养皿底层汇合度至80%，去除培养皿上的上清培养液，加入膜蛋白 酶，消化5~lOmin，每Iml消化液加入含10%FBS的PBS中止消化，W加入培养基，W lXl〇5cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37%°C，含5% %培养箱中传代培养，获 得Pl代细胞。 W81] 实施例4
[0082] 对实施例1~3及对比例1~2传代前的细胞（即PO代）进行计数；每组计数重 复3次，平均值记录如表2 :
[0083] 表2实施例1~3、对比例1~2分离的PO代细胞计数
阳0化]注：同行肩标不同字母示於0. 01
[0086] 结果显示，本发明提供的方法获得的细胞数量显著高于对比方法。
[0087] 实施例5
[0088]W本发明提供的培养液对实施例1制得的角膜缘干细胞进行传代，W对照组的培 养液对对照例3制得的角膜缘干细胞进行传代，对比观察细胞增殖率。
[0089] 实验组培养基：90%DMEM培养基+10%FBS，其中AcSDKP的质量分数为0. 5%。
[0090] 对照组培养基：90 %DMEM培养基+10 %FBS。
[0091]两组分别收集在P1、P5、P10的细胞，接种细胞于96孔板中，2000个/孔。在37°C， 5%C02培养箱中连续培养7d。分别在ld、3d、M、7d对细胞进行检测。在待检测孔中加入 10yL染色剂，37°C，5%C02培养2h。用酶标仪测450皿处的吸光值，每个样本做6个重复， 细胞增殖情况如表3。
[0092] 表3细胞增殖情况
[0093]
[0094] 通过表3可见，本发明提供的培养基和分离方法与常规方法相比，角膜缘干细胞 增殖速率有了明显的提升。 阳0巧]实施例6
[0096] 对实施例1~3,对比例1~2培养获得的Pl代细胞进行流式检测。方法为：
[0097] 1.各样品进行3次平行试验，取IX IO6Cells,平均分至2个EP管中，一管作为对 照，1500巧m/min离屯、5min，弃上清。
[0098] 2.加入1血染色缓冲液（含10% FBS的PB巧重悬细胞，1500巧m/min离屯、5min， 弃上清。重复W上步骤1次。
[0099] 3.弃上清后，每管加入200化染色缓冲液重悬，样本组分别加入2yL特异性识 别的碱性角蛋白抗体（AE5)、缝隙连接蛋白抗体（CX43抗体）、DNA聚合酶5的辅助蛋白抗 体（PCNA)和化加抗体（实验采用试剂盒，分别为Al地aDia即oesticInternational的 MonoclonalAnti-Connexin43 (Cx43)试剂盒；Biolegend的阳anti-humanPCNA试剂盒、 APCanti-Br加试剂盒和AlexaFluor吸 594anti-切tokeratin18(AE5)试剂盒）。避光 解育20min。
[0100] 4.加入500JiL染色缓冲液重悬，150化pm/min离屯、5min洗掉剩余抗体。 阳W] 5.弃上清，加入500化上样缓冲液（l〇%FBS+1640培养基），过200目筛，上机检 。结果如表4 :
[0102] 表4各组细胞流式检测结果 阳103]
[0104] 抗体AE5角膜成纤维细胞的表面标志性抗体，CX43角膜干细胞为阴性表达，PCNA 抗体阳性证明该细胞具有很强的增殖能力，间接表明角膜干细胞的极强的增殖力，化加抗 体阳性表明细胞具有长生长周期，符合角膜干细胞低分化长周期的特点。综上所述，实施例 1~3所得角膜缘干细胞纯度最高，增殖能力最高，生长周期长。而对比例1~2所得细胞 中则渗杂着少量的成纤维细胞，增殖能力和生长周期均低于实验组。因此，本发明提供的分 离方法和培养体系效果显著优于对比例。
[0105] W上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种角膜缘干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1:将胎儿角膜缘组织以复合酶酶解； 步骤2 :将所述酶解后的产物以角膜缘干细胞分离培养基培养后，传代； 所述复合酶包括中性蛋白酶和IV胶原酶； 所述角膜缘干细胞分离培养基包括AcSDKP、胎牛血清和基础培养液。2. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶中，中性蛋白酶和IV胶原 酶的质量比为3:2~2:1。3. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶与胎儿角膜缘组织的体 积比为1:5。4. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶酶解的温度为37°C，时间 为 10 ~20min。5. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶以PBS配制，pH值为7. 2。6. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶酶解的终止液为含有FBS 的PBS。7. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述角膜缘干细胞分离培养基中， AcSDKP的质量分数为0. 01 %~10%。8. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述角膜缘干细胞分离培养基中胎 牛血清与基础培养液的体积比为（10~20) : (80~90)。9. 根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述角膜缘干细胞分离培养基中基 础培养液为DMEM液体培养基。10. 根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，步骤2所述培养的接种密度为 IXIO5个/ml〇
【专利摘要】本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种角膜缘干细胞的分离方法。本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率，提高了所得细胞的纯度。该方法操作简便，不需要高端的仪器设备，对细胞的损伤也较小。实验表明，采用本发明提供的培养基分离角膜缘干细胞，每1cm3角膜缘组织能够获得8.4×105个～9.0×105个角膜缘干细胞，细胞中抗体CX43的阳性率为0，AE5的阳性率为0.1％，BrdU的阳性率为70.1％，PCNA的阳性率为82.1％。该效果显著优于现有技术。
【IPC分类】C12N5/074
【公开号】CN105219704
【申请号】CN201510791044
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 吴子杰, 张维敏
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月16日