一种高杀伤活性的免疫细胞群的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞生物学及临床医学领域，尤其涉及肿瘤免疫细胞治疗方面，具体 涉及人外周血淋己细胞在体外进行高效培养的方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的发生、发展与宿主的免疫状态有着密切的关系，传统的肿瘤治疗手段包括 手术、化疗与放疗，不但存在肿瘤迁移与复发的危险，而且具有严重的损伤正常组织和免疫 功能的副作用。肿瘤细胞免疫治疗通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和免疫杀伤功 能，可W清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞，达到预防肿瘤复发、转移及根治肿 瘤的目的，并且具有特异性强、毒副作用小等特点。肿瘤细胞免疫治疗主要是W免疫活性细 胞为载体，通过体内或体外激活免疫细胞分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能或直接杀 伤肿瘤细胞进而达到抗肿瘤的目的。
[0003] 根据免疫细胞治疗的特点及抗肿瘤的机制，细胞免疫治疗可分为主动性免疫治疗 和过继性细胞免疫治疗，或特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗。目前肿瘤细胞免疫治疗 研究主要集中在过继性免疫治疗，利用体外扩增的免疫细胞，如淋己因子激活的杀伤细胞 (LAK细胞）、肿瘤浸润的淋己细胞灯IL细胞）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）、树突 状细胞（den化iticcells，DC细胞）、自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK细胞）、基因 修饰的T细胞等进行肿瘤的治疗。
[0004] 近年来，国内外开展比较多的应用于临床上的外周血淋己细胞体外培养的方法主 要有送几类：
[0005] (1)经典的DC-CIK培养方法，结合市面上现有的商品化的淋己细胞培养基，采用 已经常规化的DC-CIK淋己细胞培养方法，应用抗人CD3抗体、IL2、GM-CSF、INF-Y等主要 刺激因子，分别刺激培养DC细胞和CIK细胞，在DC细胞经过肿瘤抗原激活后与CIK细胞共 培养。
[0006] 似自体TIL细胞（肿瘤浸润淋己细胞），TIL细胞是一群存在于肿瘤间质中的异 质性淋己细胞，在体内聚集到肿瘤部位的能力强于CIK和NK，仅杀伤其抗原特异性的肿瘤 细胞，而对其他组织来源的肿瘤细胞无杀伤作用。主要操作是从新鲜的肿瘤组织中分离TIL 细胞并用白细胞介素-2体外刺激，TIL细胞激活、扩增后成为细胞毒性T淋己细胞，并经体 外筛选和大量扩增，可W对表达特异性抗原的肿瘤细胞行使杀伤功能。
[0007] 做自体NK细胞（自然杀伤细胞）培养，NK细胞用于肿瘤的细胞免疫治疗已有 二十多年的历史，LAK细胞的主要抗瘤成分为NK细胞。主要采用建立NK细胞系和采用与 构建的工程细胞共培养来定向刺激自体淋己细胞中的NK细胞大量增殖。而关于用于共培 养的工程细胞的研究已开展很多，也得到了多种细胞因子的组合表达方案。
[0008] 但是，现有的培养方法仍存在较多的问题，主要表现在W下方面：培养方法比较复 杂，步骤较繁琐。DC-CIK需要把DC细胞和CIK细胞分离开进行培养，需要专口制备肿瘤抗 原去激活；TIL细胞培养需要配合临床手术，并且对得到的肿瘤组织需要进行TIL的分离和 进一步的培养，操作比较繁琐；NK细胞建系成功后，操作简单，但风险较高，大部分建系细 胞不能用于临床，而另外采用工程细胞共培养，存在工程细胞构建较难，即使构建成功，用 于共培养的话，还需要对工程细胞进行特殊的灭火处理。因此，现有的淋己细胞培养方法， 普遍存在操作复杂，培养时间较短的问题。并且，国内送几年在临床上开展免疫细胞治疗的 比较多，但普遍反映的是效果不佳或没有效果。因此针对送些问题，本领域尚需研发新型的 淋己细胞培养方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种人外周血淋己细胞体外培养方法，可W对人外周血淋 己细胞进行长时间（至少4周）的体外培养，得到可W高效杀伤肿瘤细胞的特定细胞群。
[0010] 本发明的第一方面，提供一种淋己细胞培养基，包含基础培养基、比-2(人白介素 2)、人CD13化(4-1BBL)、人SCF和任选的ConA(刀豆蛋白A)，其中，
[0011] 所述比-2(人白介素。的浓度为lO-lOOng/ml;
[001引 所述人CD13化(4-1BBL)的浓度为lO-lOOng/ml;
[001引所述人SCF的浓度为lO-lOOng/ml;
[0014] 所述ConA(刀豆蛋白A)的浓度为lO-lOOng/ml。
[0015] 在另一有优选例中，所述基础培养基选自下组；RPMI-1640,DMEM，IMDM。
[0016] 在另一优选例中，所述IL-2(人白介素2)的浓度为20-8化g/ml;
[0017]所述人CD13化(4-1BBL)的浓度为 20-80ng/ml;
[0018] 所述人SCF的浓度为20-80ng/ml;
[0019] 所述ConA(刀豆蛋白A)的浓度为20-80ng/ml。
[0020] 在另一优选例中，所述IL-2(人白介素2)的浓度为30-5化g/ml;
[0021] 所述人CD13化(4-1BBL)的浓度为 30-50ng/ml;
[0022] 所述人SCF的浓度为30-50ng/ml;
[0023] 所述ConA(刀豆蛋白A)的浓度为40-60ng/ml。
[0024] 在另一优选例中，所述比-2(人白介素2)的浓度为40ng/ml;所述人 CD13化(4-1BBL)的浓度为40ng/ml;所述人SCF的浓度为40ng/ml;所述ConA(刀豆蛋白A) 的浓度为50ng/ml。
[00巧]在另一优选例中，所述细胞为人外周血单核细胞。
[0026] 在另一优选例中，所述细胞为人外周血淋己细胞。
[0027] 本发明的第二方面，提供一种细胞体外培养方法，包含采用第一方面所述的淋己 细胞培养基对细胞进行培养的步骤。
[0028] 在另一优选例中，所述细胞为人外周血单核细胞。
[0029] 在另一优选例中，所述细胞为人外周血淋己细胞。
[0030] 在另一优选例中，所述方法包括W下步骤：
[00引](a)提供细胞；
[0032]化）将第一淋己细胞培养基加入到所述细胞开始进行培养，所述第一淋己细胞培 养基包含基础培养基、比-2、人CD13化、人SCF和ConA,其中，
[00对所述比-2的浓度为lO-lOOng/ml;
[0034] 所述人CD13化的浓度为lO-lOOng/ml;
[0035] 所述人SCF的浓度为lO-lOOng/ml;
[0036]所述ConA的浓度为 10-100ng/ml;
[0037] (C)在培养过程中加入第二淋己细胞培养基进行补液，所述第二淋己细胞培养基 包含基础培养基、比-2、人CD13化和人SCF，其中，
[00測 所述比-2的浓度为lO-lOOng/ml;
[0039] 所述人CD13化的浓度为lO-lOOng/ml;
[0040] 所述人SCF的浓度为lO-lOOng/ml。
[0041] 在另一优选例中，所述步骤（a)中提供外周血单核细胞。
[0042] 在另一优选例中，所述步骤（a)中提供外周血淋己细胞。
[0043] 在另一优选例中，在步骤（C)中采用W下方式进行补液；培养第一周时，每2-4天 进行等体积（根据培养细胞的现有培养液体积）补液一次；培养第二周时，每2-4天进行补 液一次，补液体积根据培养细胞的现有培养液体积，进行1-2倍体积补液；培养第H-四周 时，一周进行一次补液，根据培养细胞的现有培养液体积，进行2-3倍体积补液。
[0044] 在另一优选例中，所述方法获得细胞群，W所述细胞群的细胞总数量计，包含 5%~40%CIK细胞、5%~20%NK细胞、30%~70%DC细胞。
[0045] 本发明的第H方面，提供一种细胞群，由第一方面所述的淋己细胞培养基或第二 方面所述的方法对细胞进行培养后获得。
[0046] 在另一优选例中，所述细胞为人外周血单核细胞。
[0047] 在另一优选例中，所述细胞为人外周血淋己细胞。
[0048] 在另一优选例中，W所述细胞群的细胞总数量计，包含5 %~40 %CIK细胞、5 %~ 20%NK细胞、30%~70%DC细胞。
[0049] 在另一优选例中，W所述细胞群的细胞总数量计，包含5% -10%、10% -15%、 30-40%、5% -15%、或 20% -25%的CIK细胞。
[0050] 在另一优选例中，W所述细胞群的细胞总数量计，包含5%~10%或10% -15%的 NK细胞。
[0051] 在另一优选例中，W所述细胞群的细胞总数量计，包含50%~60%、30% -45%、 或40% -55%的DC细胞。
[0052] 本发明的第四方面，提供一种药物组合物，其特征在于，包含第H方面所述的细胞 群和医药学可接受的载体。
[0053] 本发明的淋己细胞培养方法，简单易于操作，采用细胞因子组合添加方案，淋己细 胞分离后，直接在不同时期采用不同因子添加方案的培养基即可，且中间不用去除现有培 养基，细胞培养时间至少可W培养一个月，并且通过对比现有商品化的培养基及方法，在体 外杀伤实验中，本发明方法具有更优异的杀伤活性。