促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞领域，尤其设及促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液 及方法。
【背景技术】
[0002] 牙周病是人类最常见的口腔感染性疾病，其患病率较高，被列为糖尿病的第六大 并发症，牙周组织的炎症尤其牙周炎被认为是某些全身疾病的危险因素。在现有的牙周病 治疗过程中，多是单纯的应用牙周膜间充质干细胞或者是中药组合物治疗。牙周膜干细胞 是存在于牙周组织的干细胞，其具有间充质干细胞的特性，包括多向分化潜能、明显的高增 殖活性及克隆形成能力，体外可分化为成脂成骨细胞，体内可分化为牙骨质样和牙周膜样 组织，是牙周支持组织再生和重建的基础，是理想的组织工程细胞。但是，单纯应用牙周膜 间充质干细胞或者重要组合物治疗，无法获得预期的良好效果，同时有可能产生反作用。
[0003] 随着对牙周病机制的深入研究发现，牙周病的大多数组织损伤是由于宿主的免疫 应答引起的，降低宿主的免疫应答可能会降低或减缓牙周病发展过程中的牙周组织损伤， 促进牙周组织的再生。牙周炎症部位存在大量的抗炎因子，如TSG-6(肿瘤坏死因子-a刺 激基因-6)和STC-I等，抗炎因子可W通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控 免疫应答，使机体恢复健康状态。因此，促进牙周炎症部位抗炎因子的分泌，可能会更有利 于牙周病的治疗。现在一般使用骨髓间充质干细胞或3D培养来促进牙周炎症部位抗炎因 子的分泌，但是运些方法存在来源受限制、费用较高、操作步骤复杂或效果不理想等缺陷。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因 子的培养液及方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液，为含蛋白终浓度50-200yg/ ml的条件培养基、10%FBS的DMEM/F12培养液，条件培养基为培养过牙周膜间充质干细胞 的培养液。
[0007] 优选地，所述促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液为含蛋白终浓度 100yg/ml的条件培养基、10%FBS的DMEM/F12培养液。
[0008] 所述条件培养基的制备方法，包括W下步骤：
[0009]取P1-P5代牙周膜间充质干细胞，采用含10%FBS的DMEM/F12培养液置于37°C、 5 %C〇2条件下培养，当汇合度达到80-90 %时，换成无酪红DMEM培养基，继续培养48-7化 后，收集细胞培养上清；浓缩收集的上清得到条件培养基。
[0010] 优选地，浓缩后条件培养基蛋白浓度为2-5mg/ml。
[0011] 优选地，采用P2或P3代牙周膜间充质干细胞培养制备条件培养基。
[0012] 优选地，换成无酪红DMEM培养基后，继续培养60-7化。
[0013] 本发明还提供一种促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的方法，包括W下步骤：
[0014]取P1-P5代的牙周膜间充质干细胞加入含10%FBS的DMEM/F12培养液置于37°C、 5%C〇2条件下培养，待细胞汇合度达到80-90%时，换成上述促牙周膜间充质干细胞分泌抗 炎因子的培养液继续培养12-4化。
[0015] 优选地，换成促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液后继续培养2地，所述 促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液为含蛋白终浓度IOOyg/ml的条件培养基、 10%FBS的DMEM/F12 培养液。
[0016] 优选地，使用促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液促进P2或P3代牙周 膜间充质干细胞分泌抗炎因子。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0018] 1、本发明中采用的条件培养基为培养过牙周膜间充质干细胞的培养液。条件培养 基中含有牙周膜间充质干细胞本身分泌的多种细胞因子的组合，对细胞无毒副作用，没有 引入外源性物质，安全性较高，同时降低成本；
[0019] 2、和现有的方法相比较，条件培养基具有更好的抗炎效果，能够促进抗炎因子的 大量分泌，是治疗牙周病的理想成分之一，牙周膜间充质干细胞来源不受限制，操作简单。
【具体实施方式】
[0020] 为了更好的说明本发明，下面结合具体实施例做进一步说明。本发明中使用的试 剂、仪器都是可W直接由市面购得的，本发明中使用的检测等方法除特别说明外，都是本领 域技术人员所熟知的，在此不再寶述。
[0021] 实施例1、条件培养基及其制备方法
[0022] 促牙周膜间充质干细胞抗炎因子分泌的条件培养基的制备方法，包括W下步骤：
[0023] S11、牙周膜间充质干细胞的分离及培养
[0024] 用PBS液体反复冲洗新鲜拔除的健康第S磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织；用剪刀 剪碎后加入2mg/ml的I型胶原酶（sigma)溶液，放入恒溫震荡箱（斯佳）中消化20min;消 化完成后加入等量的含10%FBS的DMEM/F12培养液值MEM/F^+IO%FBS培养液，Gibco) 终止消化，离屯、收集沉淀，接种于6孔板中，同时放置盖玻片，加入DMEM/F^+IO%FBS培养 液置于37°C、5%C02条件下培养，每3天换液一次；倒置显微镜（（奥林己斯））下观察，当 细胞生长达至80%汇合时，用0. 25%膜蛋白酶（sigma)溶液进行消化传代；
[00幼 S12、收集上清
[0026] 取P2或P3代牙周膜间充质干细胞，采用DMEM/F^+IO%FBS培养液置于37°C、 5 %C02条件下培养，当汇合度达到80-90 %时，利用PBS清洗两遍，换成无酪红DMEM培养基 (Gibco)，继续培养7化后，收集细胞培养上清共100mL;
[0027]S13、浓缩
[0028] 浓缩收集的上清得到IOml条件培养基，利用BCA检测试剂盒（碧云天）的方法测 定条件培养基中蛋白浓度为2mg/ml。
[0029] 实施例2、促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液
[0030] 使用实施例1制得的条件培养基制备促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培 养液（下文中简称为促抗炎因子分泌培养液）。本实施例中促抗炎因子分泌培养液为含条 件培养基、10%FBS的DMEM/F12培养液，在促抗炎因子分泌培养液中的条件培养基蛋白终 浓度为50yg/ml，简写为：含有50yg/ml条件培养基的DMEM/F^+IO%FBS培养液。
[0031] 实施例3、促抗炎因子分泌培养液
[0032] 使用实施例1制得的条件培养基制备促抗炎因子分泌培养液。本实施例中促抗 炎因子分泌培养液为含条件培养基、10%FBS的DMEM/F12培养液，在促抗炎因子分泌培养 液中的条件培养基蛋白终浓度为100yg/ml，简写为：含有100yg/ml条件培养基的DMEM/ Fl^lO%FBS培养液。
[0033] 实施例4、促抗炎因子分泌培养液
[0034]使用实施例1制得的条件培养基制备促抗炎因子分泌培养液，本实施例中促抗炎 因子分泌培养液为含条件培养基、10%FBS的DMEM/F12培养液，在促抗炎因子分泌培养液 中的条件培养基蛋白终浓度为200yg/ml，简写为：含有200yg/ml条件培养基的DMEM/ Fl^lO%FBS培养液。
[0035] 实施例5、促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的方法
[0036] 本实施例促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的方法，包括W下步骤：
[0037] 取P2或P3代的牙周膜间充质干细胞加入DMEM/F^+IO%FBS培养液置于37°C、 5%C〇2条件下培养，待细胞汇合度达到80-90%时，换成促抗炎因子分泌培养液继续培养 12-4 她。
[0038] 实施例6、不同条件培养基终浓度对抗炎因子分泌的影响
[0039] 本实施例考察不同条件培养基终浓度对抗炎因子分泌的影响。取P2或P3代的牙 周膜间充质干细胞铺6孔板，采用DMEM/F^+IO%FBS培养液置于37°C、5%C〇2条件下培 养，待细胞汇合度达到80-90%时，分别换成对照组1和实验组1-3中的促抗炎因子分泌培 养液，继续培养24h收集细胞。对照组1中的促抗炎因子分泌培养液不添加条件培养基，即 为DMEM/F^+IO%FBS培养液。实验组1-3采用本发明实施例2-4中的促抗炎因子分泌培 养液。为了更直观的表述本实施例中对照组及各实验组中的促抗炎因子分泌培养液的组 分，将其列明如下：
[0040]对照组 1 :DMEM/F^+10%FBS培养液，
[0041] 实验组1 :含有50yg/ml条件培养基的DMEM/F^+IO%FBS培养液，
[0042] 实验组2 :含有100yg/ml条件培养基的DMEM/F^+IO%FBS培养液，
[0043] 实验组3 :含有200yg/ml条件培养基的DMEM/F^+IO%FBS培养液。
[0044]TSG-6 (肿瘤坏死因子a刺激基因6因子）和STC-I(斯