一种移动纤维床反应器及应用于丁酸生产的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种移动纤维床反应器及应用于丁酸生产的方法。
【背景技术】
[0002]丁酸是一种重要的化工原料，在工业、农业、医药等领域有着广泛的应用。丁酸可以通过化学法和生物法生产。由于化学法污染严重，且生物法(发酵法)生产的丁酸更适应食品和医药等领域的使用要求，所以，目前有许多研究者致力于发酵法生产丁酸的研究。其中，较为突出的是Yang等人发明了细胞固定化发酵的纤维床生物反应器(fibrous-bedb1reactor，简称FBB)用于生产丁酸。相比传统的丁酸游离发酵，纤维床固定化丁酸发酵可以大幅缩短生产周期、提高终产物浓度，有利于发酵液的后续分离，但外置固定床增加了工业化应用中的成本。
[0003]本发明将FBB的棉纤维织物等纤维材料作为悬浮载体的填料，在移动床生物膜反应器(moving bed b1film reactor，MBBR)基础上开发出的一种新型高效的内置式移动纤维床反应器moving fibrous-bed b1reactor (MFBB)。与MBBR的聚乙稀、聚丙稀及涤给材质、聚氨酯泡沫体等填料相比，棉纤维材料具有较高的载体活性和单位体积固定的细胞数(细胞密度最高可运70 g/L)，此外，棉纤维材料容易获得，价格便宜，固定化成本低。
[0004]微生物细胞与吸附载体间的吸附力主要包括长程力(如静电力)和短程力(如范德华力、路易斯酸碱作用力、疏水作用力、化学键力等)。MFBB中的棉纤维在悬浮球中的填充量与FBB相比较少，酪丁酸梭菌在载体上的吸附容易受环境流体剪切力的影响。本发明对棉纤维载体进行化学修饰，加强了载体与酪丁酸梭菌间的吸附力。本发明中的MFBB具有良好的底物、终产物耐受性、高效的糖酸转化率和生产率等优点，与传统的FBB系统相比，这个新颖的MFBB系统更为简单且易于等比例工业放大扩大。
【发明内容】
[0005]为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供在移动床生物膜反应器(movingbed b1film reactor，MBBR)基础上开发一种新型高效的内置式移动纤维床反应器movingfibrous-bed b1reactor (MFBB)，用于替代传统的FBB系统，以减少在工业化应用中的成本问题。
[0006]为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种移动纤维床反应器，包括发酵罐、种子液罐和培养基罐，所述发酵罐和种子液罐之间、发酵罐和培养基罐之间通过输送管道连接，输送管道上设置有输送栗；所述发酵罐上还设置有用于检测发酵罐内液体PH值的pH检测装置，以及用于检测发酵罐内液体温度的温度检测装置，以及用于通入气体的进气管，以及用于排出废气的废气管，以及用于排出发酵罐内液体的排液管，所述排液管上设置有排液栗，所述发酵罐内还设置有用于搅拌发酵罐内液体的搅拌装置。
[0007]作为优选，所述搅拌装置为搅拌桨。
[0008]作为优选，所述温度检测装置为温度探头，所述的pH检测装置为pH探针。
[0009]一种丁酸生产的方法，其采用上述的移动纤维床反应器，包括以下步骤:
(1)、对填充材料进行化学修饰:用一定浓度的NaOH溶液对棉纤维进行碱化处理，碱化处理后的棉纤维用去离子水漂洗、烘干后用聚丙烯亚胺进行修饰，最后用戊二醛进行交联处理；
(2)、对悬浮球进行填充及处理:将经过步骤(I)修饰后的棉纤维填充在一定数量的悬浮球内，对填充后的悬浮球进行灭菌处理；
(3)、向发酵罐中加入一定量的液体培养基，将经过步骤(2)处理的悬浮球加入发酵罐内，通过搅拌使悬浮球处于流化状态；
(4)、内置式移动纤维床反应器的运行:对预装有培养基和悬浮球的发酵罐进行高温灭菌，灭菌后趁余热进行通氮气或惰性气体以维持厌氧条件，冷却后接入一定量含有丁酸梭菌的种子液，在30°C，PH6.0的条件下发酵，每隔4h取样监测OD值变化，待OD值下降至相对稳定值后取出液体培养基。
[0010]作为优选，在步骤(I)中，采用浓度为4mol/L的NaOH溶液浸泡棉纤维lh，在去离子水中充分漂洗、烘干后，在4°C环境中保存。
[0011]作为优选，在步骤(I)中使用聚丙烯亚胺(PEI)修饰上述煮沸烘干后的纤维，放置于0.2% (w/v)的PEI水溶液中浸泡2 h，用HCl调整溶液pH至7.0，在去离子水中充分漂洗，烘干，4 °C保存备用。
[0012]作为优选，使用戊二醛(GA)交联处理经PEI化学修饰的纤维，在含1% (w/v) GA的0.05 mol/L磷酸钾缓冲溶液中(pH 7.0)浸泡2 h，在去离子水中充分漂洗，烘干，4°C保存备用。
[0013]作为优选，在步骤(2)中，将棉纤维填充于悬浮球内，于121°C预灭菌60分钟，并过夜，同样条件下再灭菌60分钟。
[0014]作为优选，在步骤(3)中
培养基的装入量为发酵罐容积的40%，悬浮球的总体积为培养基的20%。
[0015]作为优选，所述培养基以葡萄糖为底物。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果是:在移动床生物膜反应器(moving bedb1film reactor，MBBR)基础上开发的一种新型高效的内置式移动纤维床反应器movingfibrous-bed b1reactor (MFFB)。与传统的FBB系统相，该反应器中的固定化细胞发酵相当稳定，菌种没有出现退化或者污染的情况，该系统操作更为简单且易于等比例工业放大扩大。通过化学修饰棉纤维载体，加强载体与固定化细胞间的吸附力，优化了反应器中纤维床的填充条件和悬浮转速。
【附图说明】
[0017]图1为移动纤维床固定化生物反应器装置图。
[0018]图2为在不同载体上吸附效率的比较。
[0019]图3为悬浮球中的棉纤维填充量对细胞吸附的影响比较(转速:100 rpm)。
[0020]图4为在不同转速中，悬浮球中的棉纤维载体对细胞吸附的影响比较(填充量为2cm6cm/0.42g)。
[0021]图5为MFBB上的重复批次和补料批次发酵曲线图(37°C，pH6.0，100 rpm)。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做一个详细的说明。
[0023]如图1所示的一种移动纤维床反应器，包括发酵罐1、种子液罐2和培养基罐3，所述发酵罐I和种子液罐2之间、发酵罐I和培养基罐3之间通过输送管道连接，输送管道上设置有输送栗4 ;所述发酵罐I上还设置有用于检测发酵罐I内液体pH值的pH探针5，以及用于检测发酵罐I内液体温度的温度探头6，以及用于通入氮气的进气管7，以及用于排出废气的废气管8，以及用于排出发酵罐I内液体的排液管9，所述排液管9上设置有排液栗10，所述发酵罐I内还设置有用于搅拌发酵罐I内液体的搅拌桨11。
[0024]一种丁酸生产的方法，其采用上述的移动纤维床反应器，包括以下步骤:
步骤(1)、填充载体的化学修饰:
1)、将小块的棉纤维置于浓度为4N的NaOH溶液中浸泡Ih，在去离子水中充分漂洗，烘干，4°C保存备用；
2)、使用聚丙烯亚胺(PEI)修饰上述煮沸烘干后的纤维，放置于0.2% (w/v)的PEI水溶液中浸泡2 h，用HCl调整溶液pH至7.0，在去离子水中充分漂洗，烘干，4°C保存备用。
[0025]3)、使用戊二酸(GA)交联处理经PEI化学修饰的纤维，在含1% (w/v) GA的0.05mol/L磷酸钾缓冲溶液中(pH 7.0)浸泡2 h，在去离子水中充分漂洗，烘干，4°C保存备用。
[0026]之所以，选用棉纤维作为载体是经过载体吸附实验后得出的。载体吸附实验:收集处于稳定生长时期的酪丁酸梭菌，离心(10000 X g，5 min，4°C)，用0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH 6.0)洗涤两次，再次悬浮于上述磷酸钾缓冲溶液中，初始0D600值在0.8-0.9之间。裁成小方块的纤维放入含100 mL菌悬液的500 mL厌氧瓶内，置于摇床中，搅拌转速控制在120 rpm，温度为37°C。酪丁酸梭菌吸附8_12h，直至菌悬液中的OD值不再降低。
[0027]吸附试验中的菌悬液的OD值使用紫外/可见光分光光度计(AmershanB1sciences，美国)于600 nm读取。一个单位的OD值相当于0.685 g/L的酪丁酸梭菌浓度(由干重法得到)。因此，静态吸附试验中的细胞负载量计算公式为:细胞负载量=(A0DX 0.685 X V X 1000) / W，其中，Δ OD为吸附前后菌悬液600 nm的吸光度的变化；V为菌悬液的体积(mL);W为棉纤维织物的质量(g)。图2为在不同载体上吸附效率的比较。其中A:棉布:经PEI处理的棉布；C:经PEI和GA处理的棉布；D:聚酯；E:经PEI处理的聚酯；F:经PEI和GA处理的聚酯。
[0028]本例，经过PEI和GA修饰后，棉纤维载体的吸附能力较强，其中经PEI和GA联合修饰后的棉纤维织物上的细胞负载量最大，比处理前的棉纤维载体和同样条件修饰后的涤给纤维分别提高了 45%和 27%(41.56 士 1.82 mg c