一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞转染领域，特别是涉及一种原代成纤维细胞SiRNA的转染方法。
【背景技术】
[0002]siRNA是一种小RNA分子(21-25 bp)，它是siRISC中的主要成员，可激发与之互补的目标mRNA的沉默，从而调节靶基因的表达、影响细胞的生物功能。由于其功能的独特性，借助基因转染，siRNA已被广泛应用于研究特定基因对器官生长、发育和分化的影响，也被作为一种基因药物试用于预防和治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、遗传性和代谢性疾病以及神经系统疾病。基因转染方法的选择和这些方法转染效率的高低，直接影响了 siRNA在这些领域的应用和发展。
[0003]基因转染是将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的过程。根据转染机制和基因运载系统的不同，基因转染可分为物理性、化学性和病毒性三种，其中脂质体和脂质体复合物转染是最常用的化学转染。与其它基因一样，siRNA转染入细胞也需要借助于病毒载体或脂质体载体。这些载体虽然作用机理不同，对细胞的毒副作用有轻有重，但大都可以有效地将基因转入已成细胞系的细胞，并已在细胞系细胞的功能和生物性状的研究中发挥过重要作用。然而研究中发现，细胞系细胞往往失去了部分源组织细胞的生物性状，它的研究结果并不能完全反应源组织细胞在体内的生物过程，因此越来越多的研究直接使用原代培养的细胞，即原代细胞。病毒载体对原代细胞的转染效率较高，但操作过程复杂、存在着可整合改变宿主细胞基因的隐患。脂质体复合物载体操作简单，不直接影响宿主基因，但对原代细胞的转染效率不高，因此，完善转染方法，提高转染效率，将使脂质体复合物转染成为简单、安全并高效的体外原代细胞的转染方法，也将更有利于研究各种目的基因对细胞生物功能的影响。
[0004]成纤维细胞是结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，在组织损伤和修复中发挥重要作用。最新研究表明，成纤维细胞还可通过自身增殖和分泌功能的调节而推动肿瘤的发展。因此，建立有效的原代成纤维细胞siRNA转染方法将不仅有利于成纤维细胞基因调控的研究，也将有利于开发出一些药物靶点来调节成纤维细胞的活性从而最终达到控制炎症和肿瘤发展的目的。
[0005]常用的脂质体或脂质体复合物转染试剂有Invitrogen公司的Lipofectamine、Qiagen 公司的 Hiferfect、Thermo Fisher Scientific 的 Darmafect。LipofectamineRNAiMAX是一种阳离子脂质体试剂，其说明书中虽然说明仅用InM siRNA即可获得较好的靶基因干扰效果，但在实际实验中发现，当用于原代成纤维细胞siRNA转染时，转染效率并不高，而提高siRNA浓度和转染试剂的含量，其毒副作用也随之提高。Darmafect也存在着类似的问题。
[0006]Hiperfect转染试剂是一种阳离子和中性脂类的复合物，能实现高效的siRNA吸收和细胞内siRNA的高效释放，而且在使用高浓度siRNA时，细胞毒副作用低。但在观察转染效率时却发现，按照常规的贴壁细胞转染方法或说明书中推荐的方法进行转染，此转染试剂的转染效率依然很低。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题是提供一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法，改进现存在的转染方法，提高siRNA在原代成纤维细胞中的转染效率。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法，包括步骤为:将成纤维细胞接种于孔板上，在接种后的一定时间内加入siRNA和转染试剂的混合物溶液进行转染，所述一定时间为30-180 min。
[0009]在本发明一个较佳实施例中，所述一定时间为30 min-60 min。
[0010]在本发明一个较佳实施例中，转染时所述成纤维细胞的接种浓度为2-6 X 14至24孔板或1.5-2.0X 15至6孔板。
[0011]在本发明一个较佳实施例中，转染时所述成纤维细胞的接种浓度为4 X 14至24孔板或1.5 X 15至6孔板。
[0012]在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA在与所述转染试剂混合后的浓度为50-200 nMo
[0013]在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA在与所述转染试剂混合后的浓度为100
nMo
[0014]在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA和转染试剂的混合物是siRNA与转染试剂按体积比为1:1_1:3进行混合的。
[0015]在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA和转染试剂的混合物是siRNA与转染试剂按体积比为1:1进行混合的。
[0016]本发明的有益效果是:本发明的原代成纤维细胞siRNA的转染方法，采用此转染方法对原代成纤维细胞进行转染，转染效率明显增加，转染效果稳定，重复性好，避免了按照常规转染方法或按照Hiperfect说明书进行实验时所出现的问题。
【附图说明】
[0017]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中:
图1是本发明中成纤维细胞传代后不同时间时加入转染试剂和siRNA，目的基因被其siRNA knock down的程度，图中所示是代表性目的基因透明质酸合成酶2基因的siRNA对其表达的抑制程度。
[0018]图2是本发明中加入转染试剂后成纤维细胞的密度，A为转染后24 h镜下观察结果，B为转染后48 h镜下观察结果，C为转染后72 h镜下观察结果，本实验重复了 3次，图中所示是一代表性实验结果，放大倍数100X。
[0019]图3是本发明中不同浓度的siRNA对目的基因knock down的效果，图中所示是不同浓度代表性目的基因HAS2 siRNA对HAS2基因表达的影响。
[0020]图4是本发明中不同浓度的siRNA对目的基因knock down的效果，图中所示是不同浓度代表性目的基因HAS2 siRNA knock down HAS2基因后，成纤维细胞合成HA能力的变化。
[0021]图5是本发明中采用的细胞接种数、接种时间和siRNA浓度(如文中所述)，在转染后24 h、48 h和72 h时对目的基因knock down的效果，图中所示是代表性目的基因HAS2siRNA 的 knock down 效果。
[0022]图6是本发明中采用的细胞接种数、接种时间和siRNA浓度(如文中所述)，在转