剂。
[028引在一个实施方案中，本发明的试剂盒可W在小瓶中包含微球，在预充式注射器中 包含溶剂。
[0289] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒可W在预充式注射器中包含微球，在单独小 瓶中包含溶剂。
[0290] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒可W在预充式注射器中包含微球，在单独安 飯中包含溶剂。
[0291] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒可W在双隔室注射器中分别包含微球和溶 剂。
[0292] 参考W下实施例，本发明将更好被理解。
【具体实施方式】
[0293]连施例1 :制备裁有antaR〇mir-92a的微球
[0294] 通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0. 2化/g且包含 游离的末端簇基的50:50PLGA共聚物。将3ml二氯甲烧添加至0. 6评LGA。将0. 3ml纯 化水中的Antagomir-92浓缩溶液（I-Ssc-miR-92a;分子量：5366g/mol(也称为Da);序 列：CCGGGACAAGTGCAAT;DNA碱基：9;LNA碱基：7 ;生产商：IDT巧Xiqon)) (222mg/ml)添加 至PLGA有机溶液中，并超声乳化20s。将运种初级乳剂添加至由1% (w/v)聚乙締醇和1% (w/v)氯化钢的水溶液组成的外相，并于约1030化pm均质化60s。将所得的第二乳剂（w/ o/w)添加至一定体积的纯化水中，通过揽拌蒸发二氯甲烧。将所得微球通过离屯、收集，用 纯化水洗涂两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为9ym(82%在5-25ym之间，0%超过 25ym)，包封效率为74%。
[0295] 图1示出了所得微球的图像。
[0296] 图2说明了微球尺寸的分布。 阳297]连施例2 :制备裁有RNA的微球
[0298]通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0. 2化/g且包含游 离的末端簇基的50:50PLGA共聚物。将3ml二氯甲烧添加至0. 6评LGA。将0. 3ml不含RNAsa 的纯化水中的RNA浓缩溶液（222mg/ml)(RNASigma5000-10000Da)添加至PLGA有机溶液 中，并超声乳化20s。将运种初级乳剂添加至由1% (w/v)聚乙締醇和1% (w/v)氯化钢的 不含RNAsa的水溶液组成的外相，并于约103(H)巧m均质化60s。将所得的第二乳剂（w/o/ W)添加至一定体积的不含RNAsa的纯化水中，通过揽拌蒸发二氯甲烧。将所得微球通过离 屯、收集，用不含RNAsa的纯化水洗涂两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为10ym(86 %在 5-25ym之间，0 %超过25ym)，包封效率为73 %。 。29引连施例3 :制备安尉剂微球
[0300]通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0.2化/g且包含游 离的末端簇基的50:50PLGA共聚物。将3ml二氯甲烧添加至0. 6评LGA。将0. 3ml纯化水 添加至PLGA有机溶液中，并超声乳化20s。将运种初级乳剂添加至由1% (w/v)聚乙締醇 和1% (w/v)氯化钢的水溶液组成的外相，并于约1030化pm均质化60s。将所得的第二乳 剂（w/o/w)添加至一定体积的纯化水中，通过揽拌蒸发二氯甲烧。将所得微球通过离屯、收 集，用纯化水洗涂两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为7ym(84%在5-25ym之间，0% 超过 25Jim)。
[0301] 要施巧1[4;制备裁有円蛋白取升1素异硫氨'酪酯白勺微球
[0302]通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0. 2化/g且包含游 离的末端簇基的50:50PLGA共聚物。将Iml二氯甲烧添加至0. 2评LGA。将0.Iml白蛋白 巧光素异硫氯酸盐水溶液（20mg/ml)添加至PLGA有机溶液中，并超声乳化15s。将运种初 级乳剂添加至由1% (w/v)聚乙締醇和1% (w/v)的水溶液组成的外相，并于约103(H)巧m 均质化60s。将所得的第二乳剂（w/o/w)添加至一定体积的纯化水中，通过揽拌蒸发二氯 甲烧。将所得微球通过离屯、收集，用纯化水洗涂两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为 9^111巧1%在5-25^111之间，0%超过25^111)。 阳30引连施例5:供麻靴紀织的动脉中洗择忡施用的研究
[0304] 在大白猪中触发AMI之后，通过置于供应梗死区域的对AMI负责的动脉的2. 5/12 同轴气球，通过冠状动脉内途径施用30mg如实施例4所示制备的包含巧光白蛋白的微 球。将微球原位悬浮于IOml包含Tween-80的生理盐水溶液中；连续两次注射5ml，每次后 接着注射5ml生理盐水溶液。实验显示可W在供应病变组织的动脉中选择性施用包封的 曰nt曰gomir〇 阳30引连施例6:微球保留在病巧紀织的毛细血管中而不外流牵血流的研究
[0306] 通过置于中间前降支的同轴气球通过冠状动脉内途径施用，在猪模型上进行4次 试验，注射2次，每次5ml如实施例4所示制备的巧光微球。将4只动物安乐死，获得邮邻 前降支的组织和被其他冠状动脉冲洗的对照组织的屯、肌样品。通过光学巧光显微镜观察样 品，证实存在保留于受损屯、肌毛细血管中的微球，W及其不存在于对照组织中。
[0307] 为了排除全身性生物分布的可能性，在前述动物的两只中，除缺血和对照屯、肌组 织外，从肺、脾和肝获得5个重复样品，用B光的光学显微镜观察。仅在前壁屯、肌壁中检测 到巧光。该分析掲示了微球保留在屯、脏中，避免了antagomir92a的全身性释放（减少副作 用）。 阳30引连施例7 :微球保留在病巧紀织的毛细血管中而不损害靴紀织本身的研究
[0309] 进行实验来调查潜在的局部屯、脏毒性和治疗安全性剂量范围。为了检测局部缺血 对屯、肌的损害，采用了在其检测缺血能力上高度敏感的2个配对压电晶体。当屯、肌组织受 缺血影响时，其他组织出现运动障碍并溶胀；运与由其余连续健康组织产生的血压一起使 微晶体分离并进一步远离彼此。在进行了开胸手术和屯、包切除之后的两只猪中插入两对微 晶体，一对对照在外侧区，和一对在由前降支（微球通过此施用）供应的前区。对于每对培 养基晶体，测量在屯、脏周期期间的两个点上它们之间的距离：在舒张结束（邸L)和收缩结 束巧化）。邸L和E化之间的关系用参数SS(收缩缩短：巧化-ESL) /邸L)表示。当左屯、室 收缩完全消失时，E化=ESLSS= 0。正常值在0. 2 + 0. 1的范围。如附图所示，研究剂量诱 导了每次注射后持续几秒钟的最小和瞬间振动，运对应于第一次和第二次注射。并且，出乎 意料地，重复冠状功脉内注射根据实施例4制备的巧光微球达到研究剂量的14倍，没有观 察到局部副作用。限制性最大剂量不与不可逆的缺血损害、血液动力学影响化emodynamic repercussion)或屯、律失常相关。
[0310] 此外，为了检测冠脉流量的变化，将流量传感器置于中间LAD来测量冠脉流量。冠 状动脉注射后没有观察到冠脉流量的明显变化。
[0311] 结果由其中注射了 120mg微球的图3和其中注射了 240mg微球的图4说明。
[0312]要施巧IS;单次筑状云力目氷内注省汁具有小剂量antagomir白勺微球白勺分子效应白勺石开究
[0313] 为了说明小剂量微包封的antagomir可W产生分子反应，冠状动脉内施用包封的 antagomi;r-92a后测量缺血和对照组织中miR-92a的体内表达。在3只猪中，将60mg根据 实施例1制备的包含antagomi;r-92a的微球（0.Img/Kg)递送至LAD。处理后第1天、第3 天和第10天将动物安乐死，在2个重复梗死和对照样品中，通过总RNA分离W及使用特定 引物的实时定量RT-PCR定量miR-92a的表达，W内源microRNA作为对照（miR-123、203和 126)(参见图5)。
[0314] 在梗死组织中，miR-92a的表达与对照组织相比下调了8倍，而内源miR的表达不 受处理影响。抑制从早至第1天开始存在，并在第10天仍然存在，比对照区的表达水平低 5倍。
[031引在内源miR中没有检测到明显调控。运些结果掲示，介质/系统为antagomi;r-92a的控制递送和释放提供足够条件，从而用单次冠状动脉内施用产生了microRNA-92a的持 续抑制。
[0316]图6所示的运些结果也证实了antagomir在微球制备过程中没有被降解。 防317] 连施例9:单次筑状动脉内注射巧含化剂量antagomir的微球的牛物效麻的研究
[0318]为了说明微球输送的antagomir-92a的分子效应是否伴随生物效应，用26只 成年小猪进行了临床前研究。该研究的目的是调查通过选择性冠状动脉内施用包封的 antagomi;r-92a来抑制mi;r-92a是否会导致梗死区血管生成的增强，从而预防屯、室重构的 发生。
[0引引施用3种制剂：
[0320]-盐水溶液（对照制剂）
[0321]-根据实施例3制备的安慰剂微球
[0322]-根据实施例1制备的antagomi;r-92a微球，W3mg/小猪为一次antagomir剂量。 [032引处理后4周，与对照相比，在接受包封的antagomir-92a的那些动物中的坏死区 中检测到明显更高的血管密度，从而证实了在之前研究中观察到的antagomir-92s的促 血管生成活性（161. 57 + 58. 71vs安慰组的68. 49 + 23. 56vs盐水组的73. 91 + 24. 97,P= 0. 001)O
[0324] ii)血管密度（参见图7)
[0325] 微血管形成在梗死区W及周边梗死边缘均有增加。那些处理动物中的微血管阻力 指数一直显示较低（200. 67 + 104. 46VS对照的511. 73 + 202. 1，P= 0.007)，运与血管密度 显著相关（R2O. 41，P= 0. 02)(参见图8)。
[0326] 处理组中的基线微循环阻力（基线MR)和实际微循环阻力（TMR化yp))显著低于 对照组（分别是 7. 47 + 1. 33vs19. 62 + 2. 98,P= 0. 005 和 5. 0 + 1. 15vs14. 49 + 2. 4,P =0. 006)。基线和实际微循环阻力与血管密度显著相关（分别是R20. 35,P= 0. 033和R20. 31，P= 0. 047)(参见图 9)。
[0327] 运些数据表明包封的antagomi;r-92a在体内诱导了持续血管生成。
[032引发现生长血管后，因此进一步调查它在AMI之后发生的愈合过程中的潜在益处。 为了确定包封的antagomir-92a对屯、室重构的作用，比较了处理和未处理组的通过立体磁 共振成像（CMR)的形态和结构参数，W及通过血管内超声屯、动图（IW)分析的功能性参数。 与处理动物相比，对照在IVE中存在明显更高百分比的具有前区和隔顶运动障碍的动物（P =0.03)(尤其参见图10)，在离体CMR中也具有明显更高的受损屯、室壁减薄W及左屯、室中 有害重构的形态变化（表3)。
[0329] 更具体地，图10说明了通过血管内超声屯、动图（IW)分析区域壁运动功能障碍的 结果。通过使用VividQ超声成像器（GEHealthcare,Belford,UK)和置于右屯、室顶端的 超声导管（Siemens)来进行。
[0330] 本研究的结果表明施用antagomi;r-92a微球与急性屯、肌梗死后有害重构的统计 学上显著的减少有关。
[03引]表3 :CMR中左屯、牵電构的参撒
[0333] 包封的antagomir-92a阻止在急性屯、肌梗死1个月后的有害的左屯、室重构。测定 各小猪中离体CMR的所有梗死片中计算的不同重构参数。示出了四只小猪中代表性的L2 片（在Ll顶端）。TgWJ^a=平均最大梗死壁厚度，用各片中最大梗死壁厚度的E除W受 影响的片数来计算；=在后乳头肌插入旁边测量的正常后壁的平均厚度，用各受影 响片中后壁厚度的E除W受影响的片数来计算；平均最小减薄百分比用[100- (Tgwj^s/Ti^^axlOO)]来计算；=平均最小梗死壁厚度，用各受影响片中最小梗死壁厚度的 E除W受影响的片数来计算；平均最大减薄百分比用[100 - XlOO)]来计 算；成:梗死壁与对侧正常壁之间的平均最大直径，用各梗死片中梗死壁之间最大直径的E除W受影响的片数来计算；化:正常壁之间的平均最大直径，与DK形成直角，与屯、室腔中屯、 最近，用各梗死片中正常壁之间最大直径的E除W受影响的片数来计算；成/化:平均球形 指数，用各梗死片中IVU的E除W受影响的片数来计算。表中数据W平均值+s.e.m表 /J、-O
[0334] 代表性CMR的结果表明：
[033引 A:小猪14 (诱导AMI之后立即死亡）的屯、脏NMR和IVE:由于紧接着AMI之后发 生死亡，没有足够的时间触发重构过程。运就是为什么观察到同轴左屯、室在所有片段中具 有相似的尺寸。
[033引 B:AMI后20-30天小猪的屯、脏NMR和IVE:有害屯、室重构的证据：AMI后一个月， 在CMR上观察到前隔段的极度消瘦，并在IVE上观察到动脉瘤形成和运动障碍，运是典型的AMI后有害重构。
[0337]C:AMI后22-30天小猪的屯、脏NMR和IVE:没有屯、室重构：AMI后一个月，在IVE中 观察到前隔区中顶叶区域的轻度减少，没有动脉瘤形成，没有运动障碍。运是AMI后有利修 复反应的典型情况。 防33引 连施俩I10 :巧卦的antag〇mir-92a诱导血管肿漓或在庶期死亡率中的作用的研究
[0339] 在对所有动物进行的尸检分析中没有观察到血管肿瘤，从而表明在远距离的其他 器官中缺少对microRNA-92a的异位全身性抑制。研究的死亡率是23%。没有观察到短期 死亡率的差异。只有一只施用包封的antagomir92a的小猪死亡（P= 0. 39)。
[0340]表 4
[0342] 连施例11;对巧圭寸的antaR〇mir_92a至皮屯、率失常谱的石开究
[0343] 为了解包封的antagomi;r-92a致屯、率失常的可能性，通过Collect5S软件 (G巧记录并分析操作期间所有的屯、律失常事件。此外，为了解决运个问题，在研究的26 只小猪中的10只中随机植入可插入式循环记录仪W检测潜在屯、律失常的发作直至死 亡（梗死形成W及处理后一个月）。与对照相比，在处理组中没有观察到玛琳屯、动过速 (mali即etachyarrh^hmias)或屯、动过缓化radiarrh^hmias)，表明冠状动脉内包封的 antagomi;r-92s没有致屯、率失常的作用。 阳344] 表5 :研究期间檢郷随I的屯、律失常
[0345]
[0346]PVC:室性早搏波群（prema1:ureventri州Iarcomplexes)，NSVT:非持续性室性屯、 动过速，
[0347]IVR:屯、室自主屯、律，
[0348]PSVC:室上性早搏波群
[0349]AMI:急性屯、肌梗死
[0350]连施巧I12 :巧1圭寸的antaR〇mir-92a矛口未巧1圭寸的antaR〇mir-92a对miR92a体夕h表 武的作用的评估
[0351] 12. 1 :材料和方法 [03閲a.细胞
[0353] 使用通过融合原代人厮静脉细胞和肺细胞A549的硫鸟嚷岭抗性克隆（ATCC'W C化-2922?)建立的人厮静脉细胞系EA.hy926。
[0354]b.处理
[0355]将大约500000个EA.hy926细胞接种在六孔板上，并于标准条件下（37°C，5% 〔02)在添加有10%胎牛血清（。8巧和21111心谷氨酷胺（51邑1]1曰,1/1316(1'油6曰11,化曰]1。6) 的RPMI1640中解育。然后用包含各自antagomir及其相应对照（PBS或微球）的新鲜完整 PRMI培养基替换培养基。用10和150nM的antagomir92a(游离的，S批antagomir92a微 球）、包封的antagomirl7或包封的antagomir20处理EA.hy926细胞。在收集用于提取RNA之前，将细胞进一步解育2地。提取总RNA，并通过定量RT-PCR定量miRNA的表达。
[0356] C.RNA提取
[0357]根据生产商的说明（Qiagen,Cou;rt油oeuf,Rrance)，分别用QiagenRNeasy微型 版（参考号74106)和RNeasy+通用试剂盒（参考号73404)从EA.hy926细胞和小猪组织中 分