离miRNA。用NanoDropND1000 分光光度计化油techInternationaLParis,Rrance) 评估提取的RNA的质量和纯度。
[035引d.miRNA的逆转录
[0359]使用!"SqManMicroRNA逆转录试剂盒(XifeTechnologies,参考号 4366596)在包 含5ng总RNA和特定miRNA探针的15ml终体积中逆转录miRNA。将样品于16°C解育30分 钟，于42°C解育30分钟，并通过加热至85°C5分钟使逆转录酶失活，然后一直冷却在4°C。
[0360]e.实时RT-PCR
[0361]理论基础。从Ct数获得定量值，在该Ct数信号的增加与开始被检测的PCR产物的 指数增长相关（根据生产商手册，使用如ants化dio6and7Flex软件）。为了控制原料 量的差异，将数据归一至2个内源对照（miRNA103和miRNA191)的几何平均数，所述对照的 表达水平经验上表明不会随处理而变化。随后将祀miRNA的值归一，从而使对照中祀miRNA 的值等于1。结果用孤Ct计算方法（RQ分析软件，AppliedBiosys化ms? )表示。
[036引PCR扩增。用QuantSl:udi0TM6Flex实时PCR系统和！"SqMan探针（Applied B始S絮沸ems猿）进行所有的PCR反应。热循环条件包括初始变形步骤（95C，10分钟） 和45个循环（95°C，15s和65°C，1分钟）。重复测试样品。
[0363] 12. 1 :结果
[0364]IOnM游离的和包封的antagomi;r-92a均抑制了miR-92a的表达，其中下降约 90%。
[036引150nM游离的和包封的antagomi;r-92a之后miR-92a的表达不可检测。
[0366]Antagomi;r-92a处理没有显著减少miR-17或miR-20a的表达。
[0367] 图11总结了运些数据。
[0368]连施例13 种巧圭寸的antaR〇mir(antaR〇mirl7、20a和92a)对其各自miR表达 的作用的体外评估
[0369]13. 1 制备裁有antaRomir-17 的微球
[0370] 通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物（i.V. 0. 2化/g)制备微 球。在PLGA有机溶液中乳化antagomir-17化SA-miR-17-5p;分子量：530抓a;序 列：CTGCACTGTAAGCACT;来自Exiqon)溶液。转而将所得乳剂融入分散的水相，并均质化W 获得理想的粒径。最后，蒸发溶剂之后，将所得微球冷冻干燥。微球的平均直径为lOym， antagomi;r-17 含量为 7. 3%。
[0371]13. 2 制备裁有antaR〇mir-20a的微球
[037引通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物（i.V. 0. 2化/g)制备 微球。在PLGA有机溶液中乳化antagomir-17化SA-miR-20a;分子量：5289Da;序 列：CTGCACTATAAGCACT;来自Exiqon)溶液。转而将所得乳剂融入分散的水相，并均质化W 获得理想的粒径。最后，蒸发溶剂之后，将所得微球冷冻干燥。微球的平均直径为lOym， antagomi;r-20a含量为6.8%。 37引13. 3结果 。：374]材料巧方法与连施例12巧同。
[037引-miR-17 被IOnM包封的antagomi;r-17 抑制了 76%。150nM包封的antagomi;r-17 处理完全消除了miR17的表达。
[0376]-miR-20a被IOnM包封的antagomir-20a处理抑制了 7 %，被150nM包封的 antagomi;r-20a处理抑制了 87 %。
[0377] 图12示出了结果。 37引 连施俩I14 :具有裁量、大小巧巧香酷/ 香酷比例特佈的S化antag〇mir92a微球 的体外评估 37引14. 1制备具有化antag〇mir-92a裁量的微球化13250:聚合物：RESOMERRG502H)
[0380]如实施例1所述，通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物（i.V. 0. 2化/g)制备微球，但采用较低的药物初始量和较高的揽拌速度W制备具有低antagomir-92a含量 的较小微球。微球的平均直径为7ym，antagomir-92a含量为1. 5%。 阳38。14. 2制备具有高antag〇mir-92a裁量的微球化13262:聚合物：RESOMERRG502H)
[0382]如实施例1所述，通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物（i.V. 0. 2化/g)制备微球，但采用较高的药物初始量和较低的揽拌速度W制备具有高antagomir-92a含量 的较大微球。微球的平均直径为15.6ym，antagomir-92a含量为9.8%。 阳38引14. 3伸用长效聚合物制备裁有antag〇mir-92a的微球化13230:聚合物：LACTCL B6006)
[0384]如实施例1所述通过乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，但采用具有高分子量 的85:15PLGA共聚物（i.V. 0. 64化/g),W获得药物缓释。微球的平均直径为12ym， antagomi;r-92a含量为 3. 1 %。 阳3财14. 4结果
[0386] 检测具有载量、大小和丙交醋/乙交醋比例特征的S批antagomir92a微球。
[0387] 根据微球含量，在2和30nM检测L13250,在14和210nM检测L13262,W及在4和 66nM检测L13230。
[038引 L13250、L13262和L13230完全消除了miR92a的表达。
【主权项】
1. 一种组合物，包含有效量的涉及血管生成的miRNA或其前体的至少一种抑制剂，其 中将所述抑制剂微包封成聚合物生物可降解且生物相容的微球。2. 权利要求1所述的组合物，其中所述miRNA选自miR-92 (包括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和miR-16-2)、miR-374(包 括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1 和miR-24-2)、miR-483、 miR-34 (包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20 (包括miR-20a和miR-20b)、miR-15 (包 括miR-15a和miR-15b)。3. 权利要求I所述的组合物，其中所述miRNA由以下成熟miRNA组成： a) 包含选自SEQIDNO:21、22或23的序列或与SEQIDNO:21、22或23之一具有至 少90%核苷酸一致性的序列的1^1?-92&; b) 包含选自SEQIDNO: 24或25的序列或与SEQIDNO: 24或25之一具有至少90% 核苷酸一致性的序列的miR-92b; c) 包含选自SEQIDNO:26或27的序列或与SEQIDNO:26或27之一具有至少90% 核苷酸一致性的序列的miR-17 ; d) 包含选自SEQIDNO:28或29的序列或与SEQIDNO:28或29之一具有至少90% 核苷酸一致性的序列的miR-503 ; e) 包含选自SEQIDNO:30、31或32的序列或与SEQIDNO:30、31或32之一具有至 少90%核苷酸一致性的序列的1^1?-16; f) 包含选自SEQIDNO:33、34、35、36、37 或 38 的序列或与SEQIDNO:33、34、35、36、 37或38之一具有至少90%核苷酸一致性的序列的miR-374 ; g) 包含选自SEQIDNO:39、40、41 或 42 的序列或与SEQIDNO:39、40、41 或 42 之一 具有至少90%核苷酸一致性的序列的1^1?-24; h) 包含选自SEQIDNO:43或44的序列或与SEQIDNO:43或44之一具有至少90% 核苷酸一致性的序列的miR-483 ; i) 包含选自SEQIDNO:45、46、47、48、49 或 50 的序列或与SEQIDNO:45、46、47、48、 49或50之一具有至少90%核苷酸一致性的序列的miR-34 ; 」）包含选自3￡0 1〇勵：51、52、53或54的序列或与5￡0 1〇勵：51、52、53或54之一 具有至少90%核苷酸一致性的序列的1^1?-20;和 k)包含选自SEQIDNO:55、56、57 或 58 的序列或与SEQIDNO:55、56、57 或 58 之一 具有至少90%核苷酸一致性的序列的1^1?-15。4. 权利要求1所述的组合物，其中所述miRNA前体由以下组成： a) 包含SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:1具有至少90 %核苷酸一致性的序列的 mir-92a_l; b) 包含SEQIDNO:2的序列或与SEQIDNO:2具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir-92a_2 ; c) 包含SEQIDNO:3的序列或与SEQIDNO:3具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir_92b; d) 包含SEQIDNO:4的序列或与SEQIDNO:4具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir-17 ； e) 包含SEQ ID NO :5的序列或与SEQ ID NO :5具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir-503 ； f) 包含SEQ ID NO :6的序列或与SEQ ID NO :6具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir-16-l ； g) 包含SEQID NO :7的序列或与SEQID NO :7具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir-16-2 ； h) 包含SEQ ID NO :8的序列或与SEQ ID NO :8具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir_374a ; i) 包含SEQ ID NO :9的序列或与SEQ ID NO :9具有至少90%核苷酸一致性的序列的 mir_374b ; j) 包含SEQ ID NO : 10的序列或与SEQ ID NO : 10具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir_374c ; k) 包含SEQ ID NO :11的序列或与SEQ ID NO :11具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir-24-l ; l) 包含SEQ ID NO : 12的序列或与SEQ ID NO : 12具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir-24-2 ; m) 包含SEQ ID NO :13的序列或与SEQ ID NO :13具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir-483 ; n) 包含SEQ ID NO :14的序列或与SEQ ID NO :14具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir_34a ; 〇)包含SEQ ID NO :15的序列或与SEQ ID NO :15具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir_34b ; P)包含SEQ ID NO :16的序列或与SEQ ID NO :16具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir_34c ; q) 包含SEQ ID NO :17的序列或与SEQ ID NO :17具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir-20a ; r) 包含SEQ ID NO :18的序列或与SEQ ID NO :18具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir-20b ; s) 包含SEQ ID NO :19的序列或与SEQ ID NO :19具有至少90%核苷酸一致性的序列 的 mir-15a ;和 t) 包含SEQ ID NO : 20的序列或与SEQ ID NO : 20具有至少90 %核苷酸一致性的序列 的 mir_15b〇5. 权利要求1-4所述的组合物，其中所述miRNA抑制剂是长度为8-49个核苷酸的具有 靶向所述miRNA或其前体的序列的寡核苷酸。6. 权利要求5所述的组合物，其中所述寡核苷酸是与所述靶miRNA或其前体至少部分 互补的反义寡核苷酸。7. 权利要求6所述的组合物，其中所述反义寡核苷酸选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷 酸、小RNA、antagomir、LNA、CDNA、PNA、吗啉代寡核苷酸或它们的组合。8. 权利要求6所述的组合物，其中所述寡核苷酸由antagomir组成。9. 权利要求8所述的组合物，其中所述antagomir包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包 含至少16个与选自SEQIDNO:1-58的序列的核苷酸互补的连续核苷酸。10. 权利要求9所述的组合物，其中所述antagomir包含序列SEQIDNO:59或60及 其除碱基替换之外的修饰，以及由至少8个连续核苷酸的SEQIDNO:59或60的子序列组 成的片段。11. 权利要求1-10所述的组合物，其中所述微球的直径不超过25ym。12. 权利要求1-10所述的组合物，其中至少50%的所述微球的直径为5-20ym，优选 5-15um〇13. 权利要求1-12所述的组合物，其中所述微球包含1% -15%w/w的抑制剂。14. 权利要求1-12所述的组合物，其中所述微球包含1% -10%w/w的抑制剂。15. 权利要求1-14所述的组合物，其中所述微球用由聚-d，1-丙交酯（PLA)组成的聚 合物制成，所述聚合物任选地与一种或多种其他聚合物共混。16. 权利要求1-14所述的组合物，其中所述微球用由聚-d, 1-丙交酯-共-乙交酯 (PLGA)组成的共聚物制成，所述聚合物任选地与一种或多种其他聚合物共混。17. 权利要求1-14所述的组合物，其中所述微球用由聚-d，1-丙交酯-共-乙交酯 (PLGA)和聚-d，l-丙交酯（PLA)组成的聚合物共混物制成。18. 权利要求16或17所述的组合物，其中PLGA聚合物中丙交酯：乙交酯的比例为 50:50至95:5摩尔比。19. 权利要求16-18所述的组合物，其中所述聚合物的固有粘度为0. 1-0. 70dl/g。20. 前述权利要求任一项所述的组合物用于治疗心肌梗死的用途。21. 权利要求20所述的组合物，其中所述心肌梗死是急性心肌梗死。22. 在需要治疗的受试者中逆转或预防心室重构的方法，包括向所述受试者施用有效 量的根据权利要求1-19任一项所述的组合物。23. 权利要求22所述的方法，其中所述施用是通过冠状动脉内途径施用。24. 生物可降解且生物相容的微球群体用于治疗或预防心肌梗死的用途，其中所述微 球： -平均直径为5-15ym; -由聚-d，1-丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA)、聚-d，1-丙交酯（PLA)或它们的共混物 制成； -包含1% -15%w/w的能够预防心室重构的治疗剂； 其中所述治疗剂由选自以下的miRNA或其前体的抑制剂组成：miR-92 (包括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和 miR-16-2)、miR-374 (包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24 (包括miR-24-l和 miR-24-2)、miR-483、miR-34 (包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20 (包括miR-20a 和miR-20b)、miR-15 (包括miR-15a和miR-15b)，优选miR-92a。25. 权利要求24所述的微球，其中所述抑制剂是antagomir。26. -种试剂盒，包括至少i)根据权利要求1-19所述的组合物和/或根据权利要求 24或25所述的微球；ii)置放所述组合物的注射器或小瓶或安瓿。27. 权利要求26所述的试剂盒，进一步包括置于溶剂容器中的溶剂。
【专利摘要】本发明涉及包含有效量的涉及血管生成的miRNA或其前体的至少一种抑制剂的组合物，其中将所述抑制剂微包封成聚合物生物可降解且生物相容的微球。本发明还涉及所述组合物用于预防或治疗心脏疾病，包括由缺血引起的心脏疾病的用途。
【IPC分类】C12N15/113, A61K31/712
【公开号】CN105229151
【申请号】CN201480017728
【发明人】M-A·阿莘, E·费雷特, A·佩雷兹, N·B·戈塔尔达, A·罗德里奎兹西诺瓦斯, I·B·瓦尔特, A·D·加西亚-多拉多加西亚
【申请人】皮埃尔法伯制药股份有限公司, 瓦尔德西布伦大学基金会医院-德雷塞卡研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年1月23日
【公告号】CA2898958A1, EP2759595A1, EP2948551A1, US20150352055, WO2014115103A1