阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽及其基因和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物工程领域，具体地指一种阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒 性的多肽及其基因和用途。
【背景技术】
[0002] 普通菜豆（PhaseolusvulgarisL.)含有碳水化合物、矿物质、多种维生素和人体 必需氨基酸等，在营养缺乏的发展中国家是重要的植物蛋白来源，在发达国家是调整膳食 结构的食品，因此，普通菜豆是全球重要的食用豆类之一。
[0003] 菜豆中毒是一种严重危害人类健康的现象。研究表明，菜豆中的菜豆凝集素会形 成二聚体复合物结合，从而凝集血细胞，引发中毒现象。凝集素中毒潜伏期一般在2-4小 时，会出现恶心、呕吐、腹痛腹泻、头疼、头晕、心慌胸闷、出冷汗、手脚发冷、四肢麻木、畏寒 等症状。目前常用的方法是在高温中破坏分解凝集素二聚体结构，从而使凝集素丧失凝血 毒性。然而，菜肴烹饪过程中不注意火候温度而产生的人中毒现象与牲畜因食用含有凝集 素植物而产生的中毒现象屡次发生，严重危害人类健康，并造成大量的经济损失。
[0004] 因此，为满足社会需求，急需研发阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的相关药 物。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性 的多肽及其基因和应用，本发明通过计算机模拟实验和生化实验定量研究菜豆凝集素凝 血毒性的强弱，并利用Fmoc固相合成的方法合成多肽（具体见步骤3)或者通过基因序列 转录翻译得到该多肽，设计的多肽具有阻断菜豆凝集素二聚体形成，从而抑制菜豆凝集素 的凝血毒性。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的 多肽，所述多肽的氨基酸序列为丝氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸，如SEQID NO: 1所示
[0007] 本发明还提供了一种编码上述多肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0008] 最优选，其核苷酸序列如SEQIDN0 :3所示。
[0009] 将上述核苷酸序列插入原核表达载体pET30中得到重组载体，再将导入大肠杆菌 中，其表达纯化得到阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽。（该方法见分子克隆手 册）
[0010] 此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术 人员，可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0011] 本发明还提供了一种上述的多肽在制备及其抗凝血和植物凝集素有关疾病的药 物中的应用。如该多肽可作为抗凝血的解毒剂，并可作为饲料添加剂等，减少因凝血毒性而 造成的生命和财广损失。
[0012] 如将抗凝血多肽的粉末用PBS缓冲液配成终浓度为0. 05mg/mL的溶液，得到制剂， 从而治疗抗凝血和植物凝集素有关疾病。
[0013] 本发明的理论基础：
[0014] 1)本发明通过计算机模拟研究可从分子层次解释菜豆凝集素的凝血功能，为设计 抗凝血多肽提供重要的理论基础和物理模型。
[0015] 2)生化实验可定量测定菜豆凝集素的凝血毒性。
[0016] 3)多肽可阻止菜豆凝集素聚合物形成，并降低凝血毒性。
[0017] 本发明的有益效果在于：
[0018] 1)本发明的多肽能判别植物凝集素的凝血毒性强弱。
[0019] 2)本发明的多肽能作为抗凝血抑制剂，从而降低人中毒的风险。
[0020] 3)本发明的多肽能作为动物饲料添加剂，从而减少因为凝血毒性问题造成的经济 损失。
[0021] 综上所述，通过本发明的设计思路，抗肿瘤等其它的多肽。并且该方法系统性、综 合性强。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的抗凝血多肽SFIVS和外源菜豆凝集素PHA-E(PDBcode: 3WCR)分 子对接结果图；
[0023] 图2为反相液相色谱分析合成的抗凝血多肽的纯度图；
[0024] 图3为抗凝血多肽的质谱图；
[0025] 图4为抗凝血多肽抗菜豆凝集素PHA-E的凝血活性图；
[0026] 图中，阳性对照组：25μLPHA-E(倍比稀释）+25μLPBS+25μL兔红血球溶液；
[0027] 多肽处理组：25μLΡΗΑ-Ε(倍比稀释）+25μL多肽+25μL兔红血球溶液；
[0028] 空白对照组：25μL多肽+25μLPBS+25μL兔红血球溶液。
【具体实施方式】
[0029] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0030] 实施例1
[0031] 阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽（以下简称：抗凝血多肽或者抗凝血 多肽SFIVS)的合成
[0032] 1)以外源菜豆凝集素ΡΗΑ-Ε为基础设计抗凝血多肽的理论基础：
[0033] 如图1所示：抗凝血多肽SFIVS和外源菜豆凝集素ΡΗΑ-Ε单体结合强度最高的前 10个结构中有7个结构，其抗凝血多肽位于菜豆凝集素的二聚体结合面。上述结果表明抗 凝血多肽SFIVS和另一个菜豆凝集素单体结构有较强的竞争关系，能减少菜豆凝集素形成 二聚体复合物的几率，从而会降低菜豆凝集素的凝血毒性。
[0034] 2)抗凝血多肽SFIVS多肽设计，主要包括分析二聚体复合物结构和设计多肽抑制 剂两个部分，具体步骤如下：
[0035] (A)选择菜豆凝集素复合物结构（PDBcode:3WCR);
[0036] (B)分析该复合物结构中单体和单体间接触面上的三级相互作用情况；
[0037] (C)选取接触面上相互作用较多的序列进行模拟分析；
[0038] (D)根据（C)中的分析结果设计多肽，并与菜豆凝集素单体结构进行分子对接模 拟分析（ZDock);
[0039] (E)选取（D)中相互作用较多，结合强度较强的多肽（丝氨酸-苯丙氨酸-异亮氨 酸-缬氨酸-丝氨酸）作为菜豆凝集素的抗凝血多肽。
[0040] 3)抗凝血多肽合成，具体步骤如下：
[0041] (A)Fmoc固相合成（利用美国PTITirbute-UV多肽合成仪合成）：
[0042]首先将？111〇(3-561&811)-^即（1.28,0.5臟〇1)树脂用匪？(51111)溶胀1小时，20% 哌啶/NMP(3mL)处理5min脱除树脂的Fmoc保护基（UV检测反应进程），连接第一个氨基 酸结页氛酸，将卩111〇(3-\%1-0!1(1.7区，51111]1〇1，1069)，！1131'1](2.(^，51111]1〇1，1069)，！10131:(0.675区， 5mmol，10eq)溶于0. 4mol/LDIPEA/NMP溶液中（3mL)，将混合液加入已脱除Fmoc保护基的 Wang树脂中，搅拌20min，抽干后NMP(4mL)洗三次，20 %哌啶/NMP(3mL)处理5min脱除氨 基酸上的Fmoc保护基（UV检测反应进行），同样的方法依次连接异亮氨酸、苯丙氨酸和丝氨 酸。
[0043] (B)树脂裂解和去保护
[0044] 将已连接5个氨基酸的多肽从多肽合成仪的反应器中取出，放入20m