一种毒沟褶菌的dna条形码标准基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种毒沟裙菌Kefleflaia)的DNA条 形码标准基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 云南是我国食用菌资源最为丰富的省份之一，其中，裂褶菌和侧耳是人们经常采 集和可食用的两种野生菌。然而，在外形上，有种叫毒沟褶菌俗称小 白菌的蘑菇却与可食用的裂褶菌和侧耳非常相似，极其容易混淆，稍不注意，就会被误当成 可食用的野生菌而采食。近年来的研究表明毒沟褶菌含有非蛋白质氨基酸等毒素成分，误 食该菌后，轻则头晕、恶心、出虚汗、心跳加速，重则死亡。自1978年以来，云南地区就报道 了超过400例不明原因猝死案例。研究人员经过长时间仔细深入的调查和研究，才发现这 种最近被命名为的"小白菌"的蘑菇竟然是30多年来导致云南不明原因猝死的主要罪魁祸 首。因此，对该物种快速和准确鉴定的研究，可以及时有效地防止人们误食该种蘑菇，或为 疑似中毒者提供一种快速鉴定通道，为公共卫生安全提供有效保障。目前，对该菌的鉴定还 依赖形态，急需一种标准基因来建立其快速的分子鉴定方法。
【发明内容】
[0003] 为克服形态学鉴定毒沟褶菌存在的缺陷，本发明提供了一种毒蘑菇一一毒沟褶菌 Kefleflaia)分子鉴定的标准基因序列及鉴定方法，可以快速准确地将该毒蘑燕从 裂褶菌、侧耳等易混淆物种中鉴定出来，从而保证人们食用野生菌的安全性和疑似该毒菌 中毒事件的快速和有效鉴定。
[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 一种毒沟褶菌的DNA条形码标准基因，条形码标准基因序列SEQIDNO. 1:TCTTGTTCTTAGTGGAGCGAGGATCGGTTCAACGAAATTGTTAAGGAAACATCTACTTTCATCAAAAAGGT CGGATACAACCCCAAGGCCGTCGCTTTCGTTCCCATCTCTGGCTGGCACGGTGACAACATGTTGGAGGAATCTACC AAGTAAGTCTTTAATGGCYGAGCCATATCATGGTTTTGATAATCGCTATCTTAGCATGTCATGGTTCAAGGGCTGGA CCAAGGAGACGAAGGCCGGTGTTGTCAAGGGCAAGACCCTTCTMGATGCTATTGACGCCATTGAACCCCCTGTGCGT CCTTCCGACAAGCCCCTCCGTCTTCCCCTTCAGGATGTCTACAAAATCGGTGGTATCGGTACTGTCCCTGTCGGTCG TGTTGAAACCGGTATCATCAAGGCCGGCATGATTGTCACTTTCGCCCCTTCAAATGTCACCACTGAAGTCAAGTCGG TCGAAATGCACCACGAGCAGCTTGAGCAAGGAACCCCTGGTGATAACGTCGGTTTCAACGTCAAGTATGTGTACTTT CCGTTCCCCTTCACCGAATCTCACTTTGTGTCAGAAACGTCTCCGTCAAGGATATTCGTCGTGGTAATGTCGCCTCC GATTCGAAGAACGACCCCTGC〇
[0005] -种应用权利要求1所述的标准基因进行毒沟褶菌分子鉴定的方法，包括以下4 个步骤： (1) 从样品组织中提取基因组DNA; (2) 以步骤（1)所提取的基因组DNA为模板，用毒沟褶菌TEF特异性引物，进行聚合酶 链式反应； (3) 对步骤（2)扩增得到的DNA产物进行测序； (4) 将测序结果与基因序列SEQIDNO. 1的进行同源性比对，若同源性在99%以上，即 可将该样品鉴定为毒沟裙菌（Z
[0006] 进一步，，所述TEF特异性引物的引物序列为： 正向引物TEF-630F: 5'CTTGTTCTAGTGGAGCGAGGAT3' ； 反向引物TEF-630R: 5'TTGGCAGGGTCGTTCTTC3'。
[0007] 进一步，聚合酶链式反应中，其扩增条件为95°C预变性3min，接下来94°C变性 30s，50°C退火1min，72°C延伸1. 5min，一共进行30-35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0008] 进一步，所述DNA产物的长度为630bp。
[0009] 一种毒沟褶菌分子鉴定的标准基因及其应用，包括TEF标准基因片段的建立和样 品的鉴别步骤；其中： (1)根据DNA条形码技术原理，采用PCR扩增方法，确保条带的纯度及可靠性。测序结 果通过手工校对、序列拼接，并确保所得序列为标准序列。从采集的毒沟褶菌样品提取基因 组DNA，利用引物进行聚合酶链式反应（PCR)扩增出样品的TEF基因，将扩增产物测序后分 析比对，优选SEQIDNO. 1引物序列扩增样品的TEF基因序列片段作为标准基因，基因序列 为： TCTTGTTCTTAGTGGAGCGAGGATCGGTTCAACGAAATTGTTAAGGAAACATCTACTTTCATCAAAAAGGT CGGATACAACCCCAAGGCCGTCGCTTTCGTTCCCATCTCTGGCTGGCACGGTGACAACATGTTGGAGGAATCTACC AAGTAAGTCTTTAATGGCYGAGCCATATCATGGTTTTGATAATCGCTATCTTAGCATGTCATGGTTCAAGGGCTGGA CCAAGGAGACGAAGGCCGGTGTTGTCAAGGGCAAGACCCTTCTMGATGCTATTGACGCCATTGAACCCCCTGTGCGT CCTTCCGACAAGCCCCTCCGTCTTCCCCTTCAGGATGTCTACAAAATCGGTGGTATCGGTACTGTCCCTGTCGGTCG TGTTGAAACCGGTATCATCAAGGCCGGCATGATTGTCACTTTCGCCCCTTCAAATGTCACCACTGAAGTCAAGTCGG TCGAAATGCACCACGAGCAGCTTGAGCAAGGAACCCCTGGTGATAACGTCGGTTTCAACGTCAAGTATGTGTACTTT CCGTTCCCCTTCACCGAATCTCACTTTGTGTCAGAAACGTCTCCGTCAAGGATATTCGTCGTGGTAATGTCGCCTCC GATTCGAAGAACGACCCCTGC〇
[0010] (2)样品的鉴别：通过将待鉴别的样品序列与标准基因进行比对，基于同源性和基 于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种，获得序列间的相似性，相似度最高 或匹配度最高或遗传距离最近的对应物种即为待鉴别的物种；具体如下： a.基于同源性鉴定规则来鉴别物种 根据测序结果，如果与所述基因序列SEQIDNO. 1的同源性在99%以上，即可判断所述 的待测样品为毒沟裙菌Kefleflaia)。
[0011] b.基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种 将标准基因序列和待鉴定的样品序列与裂裙菌coa皿we)和侧耳to?osireato?)的TEF序列合并应用MEGA或PAUP软件构建NJ系统发育树，检验 未鉴定样品的DNA条形码序列与标准基因序列聚类在一起的物种，若未知样品与数据库中 的物种构成单支系，则鉴定为该物种。
[0012] 本发明的优点在于： 1、优选TEF基因作为最适合鉴别毒沟褶菌（7：κ郎郎ate)的DNA条形码，相比于其他 基因，TEF序列具有通用、易扩增、易比对的特点。
[0013] 2、建立了毒沟褶菌（7：K￡W￡waia)的标准基因序列和样品的鉴别方法，相比于传 统的形态学鉴定方法，大大提高了鉴定效率。该方法对于样品的完整程度要求低，鉴别指标 能够量化，这对于及时判定该类毒蘑菇中毒事件的来源提供了有效的依据。此外，加入了形 态学混淆种(裂褶菌和侧耳）并