具有降低的免疫原性的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学领域且更特别设及抗-淋己细胞血清（AL巧和抗-胸腺细胞球 蛋白（ATG)及其在人体医学中的用途。
【背景技术】
[0002] 本领域中已知同种异体移植排斥主要设及激活的人T细胞，其与供体的细胞抗原 接触时转化成破坏移植物细胞的有害的效应淋己细胞。
[0003] 为确保成功的器官移植和移植物的长期存活，已提出通过施用抗-淋己细胞血清 (AL巧和抗-胸腺细胞球蛋白（ATG)抵消移植患者的T细胞针对移植物的有害效应（Mohty Μ等，BestPract.Res.Clin.Haematol. , 2010Jun;23 (2) : 275-82)。
[0004] 而且，按照一种不同的治疗策略，移植的患者中Τ细胞有害效应的降低已通过使 用针对特定膜结合抗原（membrane-borneantigen)的单克隆抗体来获得。值得提到的是 己利昔单抗（其为针对激活的淋己细胞上的白介素-2受体（IL-2R)的α亚基（CD25)的 单克隆抗体）的使用。还可W提到阿仑单抗（^〔日1119日1:11、]/[日13〔日1119日1:11或〔日1119日1:11-^销售 且当前作为Lemtrada进一步开发）（其为针对成熟淋己细胞表面上存在的细胞表面糖蛋白 (CD52)的单克隆抗体）的使用。
[0005] 明显地与单克隆抗体如己利昔单抗或阿仑单抗相比，ALS和ATG抑制多种不 同的受体，从而引起显著的T-淋己细胞耗竭（S Louis等，化ansplantation, 2007,V ol. 83:712-721)〇
[0006] 因此，本领域中已知ALS和ATG可w降低急性排斥反应的发生率，也可w 治疗急性排斥反应事件W及改善移植物存活（G油erAO等，Drugs. 20lOApr16 ; 70 (6): 691-732;LawenJG等，Transplantation2003, 75:37-43;LeeBM等，Transplant. Proc.2006,38:2025-2028;GaberAO等，Drugs. 2010Apr16 ;70 化）：691-732;MohtyM 等，BestPract.Res.Clin.Haematol. , 2010Jun;23 (2) : 275-82)。
[0007] 例如，迄今为止，ALS和ATG是肾移植诱导（in化ction化rki化ey)的最常见的 治疗。
[000引 ALS和ATG是针对人细胞（特别是人T细胞）的非人动物来源的多克隆抗体的输 液。更特别地，在意图用于人体使用的ALS和ATG的情况中，ALS和ATG是通过用异种细胞 (尤其淋己细胞），特别是人淋己细胞、人胸腺细胞和人永生化细胞系，免疫非人动物如兔 和马获得的血清多克隆抗体。
[0009]ALS和ATG具有免疫抑制剂作用（其已在人体中证明）并因此用于预防和/或治 疗移植排斥，包括用于预防和/或治疗器官移植中的急性排斥反应。
[0010] ALS和ATG也用于预防和/或治疗再生障碍性贫血W及移植物抗宿主病 (GVHD)(Norbert化icldiofen等，N化gl J Med 1991，324:1297-1304;Kaya B等，J. 01111.化地〇1.58(9):994-5;516111尺5等，4111116(18(^.1994 06。；308化）：338-43; Baci阱lupo A等，Blood 98(10):2942-7巧acigalupo A等，Biology of Blood and Marrow Transplantation12巧）：560-5)。
[0011] 但是，常规ALS和ATG已知与不希望的副作用相关灯U等，Chin.Med. J.，2012, 125 巧）：1664-1666;WANG等，Chin.Med.J.，2012, 125 化）：1135-1140)。
[0012] 特别地，常规ALS和ATG已知从短期来看与细胞因子释放综合征（cytokine releasesyn化ome)相关和从长期来看与移植后淋己增生性障碍的更高风险相关。
[0013] 而且，尽管它们当前与其它免疫抑制药物一起施用，但ALS和ATG仍然是强免疫原 性的并导致产生免疫复合物（1C)相关疾病，包括重度1C表现如皮疹、发热等。
[0014] 就此而言，本发明人首次证明血清病的发生是与晚期移植物丢失关联的独立变 量。而且，本发明人首次观察到移植后数年中血清病与抗化u5GcIgG抗体的增加之间的统 计学显著的相关性（参见W下实施例4)。
[0015] 因此，仍然存在着提供具有降低的副作用的组合物的需要，包括针对常规ALS或 ATG组合物进行改进的或作为其替代的，且与常规ALS或ATG相比免疫原性显著降低的和理 想地不设及1C相关疾病的表现的组合物。
【发明内容】
[0016] 根据第一方面，本发明设及包含针对人细胞的多克隆抗体的组合物，其中所述多 克隆抗体缺乏选自包括（i)N-^乙酷神经氨酸（N-glycolneuraminicacid) (Neu5Gc)和 (ii)α-1，3-半乳糖的组的第一抗原决定簇。
[0017] 根据另一方面，本发明设及用于产生根据本发明的多克隆抗体的组合物的方法， 包括W下步骤：
[0018]a)提供缺乏选自包括（i)编码功能性胞巧-5'-单憐酸Ν-乙酷基神经氨酸水解酶 (CMAH)的基因和（ii)编码功能性α-(1,3)-半乳糖基转移酶的基因的组的第一基因的遗 传改变的非人哺乳动物；
[0019]b)针对人细胞免疫所述遗传改变的非人哺乳动物；和
[0020]C)收集步骤b)的所述遗传改变的非人哺乳动物的体液中包含的抗体。
[0021] 如本领域中已知的，抗人细胞的抗体可W容易地通过施用包含目标人细胞的免疫 原性组合物来免疫非人哺乳动物（其包括猪、马或兔）而获得。
[002引运特别地通过制备称为"ALS"和"ATG"的组合物来举例说明，该组合物分别通过 用人细胞（即，人淋己细胞和人胸腺细胞）免疫非人哺乳动物获得。
[0023] 然后，抗任何种类的人细胞的多克隆抗体可W通过用所述人细胞免疫非人哺乳动 物获得。
[0024] 运包括具有治疗益处的多克隆抗体，该抗体针对不希望其在人类机体中存在的细 胞。
[0025] 运包括针对对于人体机体发挥有害作用的细胞（如对组织移植物或器官移植物 有害的淋己细胞或者如具有失调的增殖特性的细胞，如恶性细胞（肿瘤细胞或癌细胞））的 多克隆抗体。
[0026] 因此，所述人细胞可W优选地选自包括人淋己细胞、人胸腺细胞和人癌细胞的组， 更特别地包括人淋己细胞和人胸腺细胞的组。
[0027] 本发明还设想缺乏选自包括ω编码功能性胞巧-5'-单憐酸N-乙酷基神经氨酸 水解酶（CMAH)的基因和（ii)编码功能性α-(1,3)-半乳糖基转移酶的基因的组的第一基 因的遗传改变的非人哺乳动物用于产生包含针对人细胞的多克隆抗体的组合物的用途。
[0028] 实施运种遗传改变的非人哺乳动物的进一步优势在于所述遗传改变的非人哺乳 动物在不改变饮食的情况下仅产生最少量的抗化uGc抗体，如实施例3和图5中显示的。因 此，运避免了在所述遗传改变的非人哺乳动物的血清注射到人类患者中之前该血清的免疫 吸收（immune-abso巧tion)的步骤。
[0029] 根据另一个方面，本发明设及用于在需要的个体中诱导免疫抑制状态的方法，所 述方法包括向所述个体施用按照本发明的组合物的步骤。
[0030] 根据另一个方面，本发明设及本发明的组合物，其用作药物。
[0031] 本发明还设及如上所述的组合物，其用于预防和/或治疗选自包括移植排斥、再 生障碍性贫血、移植物抗宿主病、重度自身免疫病和恶性细胞相关疾病的组的病症。
[0032] 根据再另一个方面，本发明设及如上所述的组合物，其用于预防和/或治疗移植 排斥，尤其是肾移植排斥。
[0033] 本发明还设想如上所述的组合物，其用于预防移植后1C相关疾病，特别是血清 病、皮疹或发热。
[0034] 在一些实施方式中，包含多克隆抗体的组合物选自包括抗-淋己细胞血清（ALS) 和抗-胸腺细胞球蛋白血清（ATG)的组。
【附图说明】
[0035] 凰丄:显示从已经接受至少一个肾移植和采用ALS或ATG的诱导治疗且就此 而言已发生免疫复合物（1C)相关疾病的患者值IVAT数据库的多中屯、同期组，Nantes TransplantationInstitute,Nantes)收集的数据关于显示出血清病和相关副作用的患者 部分相对于长期移植物存活的曲线图（横坐标：时间段月计）；纵坐标：％移植物存 活）。
[0036] 凰立显示从已经接受肾移植和采用ALS或ATG的治疗且就此而言已发生免疫 复合物（1C)相关疾病的患者值IVAT数据库的单中屯、同期组，Nantes化ansplantation Institute,Nantes)收集的数据关于显示出血清病和相关副作用的患者部分相对于长期移 植物存活的曲线图（横坐标：时间段（W月计）；纵坐标：％移植物存活）。
[0037] 图3:显示从已经接受首次肾或肾/族巧植和采用ALS或ATG的治疗目.就此 而言已发生免疫复合物（1C)相关疾病的患者值IVAT数据库的单中屯、同期组，Nantes TransplantationInstitute,Nantes)收集的数据关于显示出血清病和相关副作用的患者 部分相对于长期移植物存活的曲线图（横坐标：时间段年计）；纵坐标：％移植物存 活）。
[0038] 凰尘显示通过流式细胞术检测显示免疫的猪的血清中抗人TOL抗体的量的曲线 图。
[0039] 图5:显示了示出用于檢测猪血清中抗-Neu5GcIgG的ELISA分析的曲线图。
[0040] 图1和2分别设及多中屯、和单中屯、DIVAT同期组，但已经用于统计学研究的图3 设及更同质的单中屯、同期组值IVAT，Nantes),如W下表A-C中所示的。
【具体实施方式】
[0041] L定女
[0042] 为了使本发明可W被更完全地理解，下面给出几个定义。运些定义意图涵盖语法 同义词。
[0043] 术语"抗体"在本文中W最广泛的含义使用。"抗体"是指至少包含（i)Fc区和（ii) 源自免疫球蛋白的可变区的结合多肤结构域的任何多肤。因此抗体包括，但不限于全长免 疫球蛋白、抗体、抗体偶联物及各自的片段。术语"抗体"和"免疫球蛋白"在本文中可W互 换使用。
[0044] 术语"抗体"涵盖如上所述的多肤，其进一步包含不同于选自包括ωΝ-径乙酷神 经氨酸（Neu5Gc)和/或（ii)α-1，3-半乳糖的组的抗原决定簇的至少一个糖部分。
[0045] 本文中使用的"多克隆