)中公开的一种。
[0178] 用于试验中的人Τ淋己细胞永生化细胞系是可在American Type化Iture Collection W参考号邸L2899获得的化rkat细胞系（其也可W在本文的实施例中称为 "T-细胞"）。 阳17引 1)对于人淋产i田胸T免巧双電GAL/CMAHK0猪的方案
[0180]LutzAL等（Xenohansplantation, 2013 ;20 (1) : 27-35)或ConchonS.等 (Xenotransplantation；specialissueInternationalXenotransplantation AssociationIXA2013, 2013,Vol. 20,Issue5)中描述的双重GAL/CMAHKO猪的免疫通过 施用3x108Τ-细胞进行。
[0181] 在第0、14和21天进行Ξ次静脉内注射。
[0182] 任选地，在第5天W1〇7-1〇8细菌/10剂静脉内施用10个剂量的BCG或任何类型 的佐剂。
[0183] 在第28天通过放血收集血清。收集约100ml的猪血清。 阳184] 2)用于从双電GAL/CMAHK0猪巧得ALS的方案
[0185] 使上述猪血清在Whatman纤维素DEAE上进行色谱分析和然后用憐酸氨二钢缓冲 液1. 5g/L，pH8进行洗脱步骤。
[0186] 通过用180g/l，之后170g/L，pH7的硫酸钢进行的双重沉淀纯化获得的丫 -球蛋 白溶液。将沉淀物重新溶解在0. 3M甘氨酸，pH7的溶液中，W获得等于初始体积的体积。
[0187] 或者，上述纯化步骤可W使用蛋白A和之后使用离子交换柱进行。
[0188] 在人红细胞的球粒上进行溶液的血吸附化ema-adsorbing)两次（各次吸附的球 粒体积基本上等于粗血清的体积）W降低血细胞凝集素的比率。再次用硫酸钢沉淀溶液W 除去血红蛋白。将沉淀物溶解在0. 3M甘氨酸缓冲液中，针对甘氨酸10g/l，^Cl2g/l，甘 露醇lOg/L的最终溶液透析。添加蛋白质到5g/l，且然后冻干。 阳18引注释:
[0190] 从双重GAL/CMAHK0猪获得的ALS特别有利，因为其与常规ALS相比具有显著低 的免疫原性。
[0191] 因此运一ALS允许减轻移植的患者可能在同种异体移植或异种移植后发生的免 疫复合物（1C)相关疾病。而且，运一ALS也允许减轻可能进一步出现的血清病。
[0192] 所有运些优势必然地改善长期移植物存活。 阳19引连施例2 :双電GAL/CMAHK0猪针对人T细胸（或人PBL)的免巧巧麻
[0194] 根据实施例1的双重敲除猪（其中不考虑BCG或任何其它类型的佐剂）及其野生 型对应物的免疫通过Ξ次连续注射憐酸盐缓冲盐水中的30xl06化rkat细胞进行：第0天的 第一次皮下注射后第14和28天的两次静脉内注射。化rkat细胞在无化u5Gc培养基和化 合物中培养。血液在第35天采样，且血清用于进一步试验或IgG的纯化。
[0195] 所述血清中人PBk特异性抗体的检测采用化irierN等，JournalofSurgical Research, 2007中描述的方案。简言之，在4°C下2, 5xl〇s的人外周血单核细胞与不同稀释 度的免疫的猪血清（1:5-1:5000) -起解育30分钟，或者没有血清作为阴性对照。在FACS 缓冲液（PBS，1 %BSA，0, 1 %叠氮化物）中洗涂后，细胞在4°C下与1:30稀释度的門TC-标 记的山羊抗-猪IgG抗体（AbDSerotec，参考号：AAI41巧一起解育30分钟。细胞在重悬 浮于FACS缓冲液中之前洗涂Ξ次并立即在抓FACSCanto?II上进行分析。
[0196] 对于在免疫方案的第35天采样的血清，结果显示为相同试验中的中位巧光强度。 阳197]结果:
[0198]结果显示在图4中。较强的强度对于双重GAL/CMAHK0猪的血清观察到。因此， 所述双重K0猪在用化rkat细胞免疫后发生针对人PBL(=外周血淋己细胞）的强烈反应。 阳19引连施例3 :双電GAL/CMAHK0猪中杭-Neu5Gc杭体（或杭-Neu5GcI施）的测量 [0200] 实施例2的免疫猪血清（免疫方案的第35天采样的）中的抗-Neu5Gc抗体使用来 自于Scobie等，JImmunol.，2013的经改进W提高特异性的化ISA分析来定量。简言之， 平板用野生型小鼠血清（含化u5Gc)在4°C下涂覆过夜，然后使用PBS1%卵白蛋白0,05% Tween在室溫下封闭2小时。在此期间，样品在冰上与来自CMAH-K0小鼠（无化u5Gc表达） 的血清预解育2小时，有或没有5mM的合成化u5Gc(用于抗-Neu5Gc抗体的竞争吸收）。样 品然后在室溫下添加到化ISA平板2小时。辣根过氧化物酶-标记的山羊抗-猪IgG(Fc) 第二抗体（AbDSerotec，参考号：AAI41巧用于检测抗-Neu5Gc抗体，且平板使用TMB底物 (Sigma-Al化ich)显示。光强度在MRX读板仪值ynatechL油oratories)上阅读。结果表 示为用合成的化u5Gc抑制的或未抑制的孔的光强度之间的差异。 阳20。结果:
[020引结果显示在图5中。因此，双重GAL/CMAHK0猪仅产生最小量的抗化uGc抗体，其 证明不需要免疫血清吸收。 阳20引连施例4 :血清病的诊断巧腎務植物存活，.间的关联
[0204] 该研究评估从已经接受首次肾或肾/膜移植和采用ALS或ATG的治疗且就此 而言已发生免疫复合物（1C)相关疾病的患者值IVAT数据库的单中屯、同期组，Nantes TransplantationInstitute,Nantes)收集的数据中相对于长期移植物存活的显示出血清 病和相关副作用的患者比例。
[0205] 所述研究通过图3及W下Ξ个表A-C说明。
[0206] 表A显示构成所考虑的同期组的患者的特征。表B和C显示分别通过单变量Cox 和多变量Cox模型的存活分析。
[0207]表A [020引
[0209]
[0210] *冲RA:群体反应性抗体。
[0211]表B
[0212]
[021引
[0214] *单变量分析。显著性变量（p<0. 20)，
[0引引林PRA:群体反应性抗体.
[0216]表C
[0217]
[021引*多变量分析。显著性变量（p<0. 05)，
[0219] 冲RA:群体反应性抗体。
[0220] 注释:
[0221] 关于运些临床数据（参见图3)，发明人证明血清病发生率是与晚期移植物丢失关 联的独立变量。
[022引此外，发明人证明对于所述血清病的相对风险（对于"危险比"为"皿"）在急性排 斥后分级为2并高于所有测试的变量。
[0223] 最终，发明人观察到在移植后数年血清病与整体抗-Neu5Gc IgG抗体增加之间的 统计学显著的相关性。
【主权项】
1. 一种包含针对人细胞的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体缺乏选自包括 (i)N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc)和（ii)α-1，3-半乳糖的组的第一抗原决定簇。2. 根据权利要求1的组合物，其还缺乏与第一抗原决定簇不同的第二抗原决定簇且其 中所述第二抗原决定簇选自包括（i)N_轻乙酰神经氨酸（Neu5Gc)的（ii)α-1，3-半乳糖 的组。3. 根据权利要求1和2任一项的组合物，其中人细胞选自包括人淋巴细胞、人胸腺细胞 和人癌细胞的组。4. 根据前述权利要求任一项的组合物，其是针对人细胞的血清，所述血清优选选自包 括抗-淋巴细胞血清（ALS)、抗-胸腺细胞球蛋白血清（ATG)和抗-癌细胞血清的组。5. -种用于产生根据权利要求1-4任一项的组合物的方法，包括以下步骤： a) 提供缺乏选自包括（i)编码功能性胞苷-5'-单磷酸Ν-乙酰基神经氨酸水解酶 (CMAH)的基因和（ii)编码功能性α-(1，3)_半乳糖基转移酶的基因的组的第一基因的遗 传改变的非人哺乳动物； b) 针对人细胞免疫所述遗传改变的非人哺乳动物；和 c) 收集步骤b)的所述遗传改变的非人哺乳动物的体液中包含的抗体。6. 根据权利要求5的方法，其中所述遗传改变的非人哺乳动物还缺乏不同于所述第一 基因的第二基因，所述第二基因选自包括（i)编码功能性胞苷-5' -单磷酸N-乙酰基神经 氨酸水解酶（CMAH)的基因和（ii)编码功能性α-(1，3)_半乳糖基转移酶的基因的组。7. 根据权利要求5或6的方法，其中步骤b)的人细胞选自包括人淋巴细胞、人胸腺细 胞和人癌细胞的组。8. 根据权利要求5-7任一项的方法，其中所述体液选自包括血浆和血清的组。9. 根据权利要求5-8任一项的方法，其中所述非人哺乳动物由猪组成。10. 缺乏选自包括（i)编码功能性胞苷-5'-单磷酸N-乙酰基神经氨酸水解酶（CMAH) 的基因和（ii)编码功能性α-(1，3)-半乳糖基转移酶的基因的组的第一基因的遗传改变 的非人哺乳动物用于产生包含针对人细胞的多克隆抗体的组合物的用途。11. 根据权利要求10的用途，其中所述遗传改变的非人哺乳动物还缺乏不同于所述第 一基因的第二基因，所述第二基因选自包括（i)编码功能性胞苷-5' -单磷酸N-乙酰基神 经氨酸水解酶（CMAH)的基因和（ii)编码功能性α-(1，3)-半乳糖基转移酶的基因的组。12. 根据权利要求10或11的用途，其中人细胞选自包括人淋巴细胞、人胸腺细胞和人 癌细胞的组。13. 根据权利要求10-12任一项的用途，其中所述组合物是针对人细胞的血清，所述组 合物优选选自包括抗-淋巴细胞血清（ALS)、抗-胸腺细胞球蛋白血清（ATG)和抗-癌细胞 血清的组。14. 根据权利要求1-4任一项的组合物，其作为药物的用途。15. 根据权利要求1-4任一项的组合物，其（i)用于预防和/或治疗选自包括移植排 斥、再生障碍性贫血、移植物抗宿主病、重度自身免疫病和恶性细胞相关疾病的组的病症或 (ii) 用于预防移植后免疫复合物（1C)相关疾病，特别是血清病、皮疹或发热的用途。
【专利摘要】本发明涉及包含针对人细胞的多克隆抗体的组合物及其用作药物的用途，其中所述多克隆抗体缺乏选自包括(i)N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和(ii)α-1,3-半乳糖的组的第一抗原决定簇。
【IPC分类】C07K16/18
【公开号】CN105263960
【申请号】CN201480032734
【发明人】J-P·苏利卢, M·吉拉尔, G·库夫拉-德韦尔涅
【申请人】国家医疗保健研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年4月17日
【公告号】CA2909139A1, EP2986639A1, US20160075770, WO2014170867A1