一种无创性获取胎儿完整基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学领域，具体地说，是关于一种无创性获取胎儿完整基因组DNA的 方法。
【背景技术】
[0002] 产前诊断是在胎儿出生前，利用各种技术方法诊断胎儿是否患有遗传病或先天性 疾病的一种手段，是人类细胞遗传学、分子遗传学、生物化学和临床医学实践相结合的一口 学科。通过产前诊断，对可能出现遗传病或与遗传因素有关的疾病W及具有其他导致崎胎 因素的高风险胎儿提供充足可靠的信息，科学指导妊娠期的挟择或适当治疗，达到减少缺 陷儿出生率从而实现国家优生优育的目标。
[0003] 现有的产前诊断技术主要包括有创性产前诊断和无创性产前诊断两种类型。有创 性产前诊断主要包括羊膜腔穿刺、绒毛取样、厮血取样、胎儿镜和胚胎活检等，W羊膜腔穿 刺和绒毛取样两种最常用，是目前产前遗传诊断的主要方法。然而，对胎儿有创取材时存在 W下风险；1、胎儿一过性必动过缓；2、0. 1 %~0. 9%的被检者发生早产或胎儿宫内死亡； 3、厮带取血后厮带胎盘渗血；4、羊膜腔内感染；5、羊膜破裂；6、胎儿崎形。无创性产前诊断 包括超声波检查、母体外周血清标志物测定、无创胎儿基因和细胞遗传学分析等。
[0004] 在无创性方法中，超声波检查应用最为广谱，但其只能从形态上分辨一些有明显 先天崎形的胎儿，对于形态正常而带有其它遗传缺陷的胎儿则无法鉴别。采用来自母体外 周血液中的胎儿细胞或者母体血浆、血清中胎儿核酸进行无创性产前诊断的新技术显然具 有更大的应用前途。孕妇血浆及血清中存在胎儿游离DNA及RNA，通过提取母体血液的总 DNA和RNA，可用于唐氏筛查、鉴定男性胎儿、诊断化D血型不合性溶血等。然而由于现有技 术无法从母体血液总DNA和RNA中分离出完整的胎儿基因信息，绝大多数的遗传病都无法 W类似的无创方法进行检测。妊娠期间，由于胎盘界面的胎儿-母体输血，少数胎儿细胞可 通过胎盘屏障进入到母体循环中，主要有Η种细胞：滋养细胞、淋己细胞和胎儿有核红细胞 (fetalnuclearredbloodcells,FNRBC)。FNRBC在孕早期存在于胎儿循环中的数量最 多，提示其在母体循环系统中存在数量也较多；另外FNRBC在孕妇外周血中的寿命十分有 限，任何利用FNRBC进行的产前诊断都不可能受到既往妊娠的FNRBC的影响。因此FNRBC 是孕早期从孕妇外周血中分离胎儿细胞用于产前诊断的最佳细胞类型。但由于FNRBC在母 体外周血中的数量极其有限，各种报道的分离、富集、鉴定胎儿有核红细胞的方法，都存在 操作繁琐，缺乏经济实用性的缺陷，无法达到无创产前遗传诊断的要求。由于现有技术都无 法彻底解决产前遗传诊断的物质基础问题，因此，有必要提供一种精确、简单、高效的无创 性获取胎儿完整基因组DNA的方法。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有报道的分离、富集、鉴定胎儿有核细胞的方法中存在的操作繁琐、 缺乏经济实用性的缺陷，本申请的发明人结合个体遗传特征鉴定的方法，可直接定位胎儿 有核细胞，利用激光捕获显微切割技术，切割胎儿细胞，从而精确获得胎儿来源的全基因组DNA，为无创性产前遗传诊断应用奠定了物质基础。
[0006] 因此，本发明的目的在于提供一种精确、简单、高效的无创性获取胎儿完整基因组 DNA的方法。
[0007] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0008] -种无创性获取胎儿完整基因组DNA的方法，包括W下步骤：
[0009]A)从母体（孕妇）外周血中分离有核细胞；
[0010] B)制备有核细胞涂片；
[0011] C)对比分析胎儿特有或父源特有（母源无）遗传标记；
[0012] D)合成胎儿特有或父源特有（母源无）遗传标记探针，标记胎儿有核细胞；
[0013]巧显微切割分离被标记的胎儿有核细胞；
[0014]巧对切割所得胎儿有核细胞单细胞进行高保真全基因组DNA扩增。
[0015] 根据本发明，所述母体（孕妇）外周血为妊娠5~38周的母体（孕妇）外周静脉 血。
[0016] 根据本发明，所述对比分析胎儿特有或父源特有（母源无）遗传标记包括使用SNP 组合或STR组合的个体遗传标记分型鉴定。
[0017] 根据本发明，所述合成胎儿特有或父源特有（母源无）遗传标记探针，包括使用 SNP探针、STR探针或其组合。
[0018] 根据本发明，所述合成胎儿特有或父源特有（母源无）遗传标记探针还包括使用 生物素、地高辛、dinitrophenyl、aminoacetylfluorine或其组合进行探针标记的步骤。
[0019] 根据本发明，所述标记胎儿有核细胞包括应用原位杂交技术进行标记。
[0020] 根据本发明，所述原位杂交技术包括英光原位杂交技术。
[0021] 根据本发明，所述英光原位杂交技术包括单色英光原位杂交、多色英光原位杂交、 DNA纤维英光原位杂交或其组合。
[0022] 根据本发明，所述显微切割分离胎儿有核细胞包括使用激光捕获显微切割仪器进 行单细胞分离。
[0023]目前没有成熟的无创胎儿完整基因组的获取技术，与现有的胎儿遗传物质获取方 法（羊水穿刺取细胞及分离外周血游离DNA片断）相比，本发明具有如下有益效果：
[0024]1、无创性；产前取孕妇外周血，对胎儿无创伤，对孕妇的影响也极其轻微，而羊水 穿刺对胎儿及孕妇会造成诸多伤害；
[00巧]2、及早性：最早可在孕9周进行遗传检测，对相关疾病可做到早发现早预防早治 疗，而羊水穿刺一般要到15周W后胎儿发育足够大W后才能进行；
[0026] 3、经济实用性；现有的胎儿细胞富集方法存在操作过程繁琐、价格昂贵、实用性较 差的缺陷，而本发明方法的成本和羊水穿刺及分离外周血游离DNA相当，较W往胎儿全基 因组获取方法更为简单、经济、操作方便，具有广泛的经济实用性和临床推广价值；
[0027] 4、精确性：将胎儿父亲/母亲外周血（含胎儿遗传标记）与母亲体细胞进行遗传 标记对比分析，利用差异性遗传标记进行原位杂交的方法，可W从母亲的外周血液中，精确 找出胎儿的单细胞，采用激光捕获显微切割技术直接获得所需的单个细胞，从而得到胎儿 细胞的基因组，确保了胎儿细胞基因组DNA的来源和完整，避免了母源基因的干扰，保证诊 断结果的准确性，而分离孕妇外周血的方法会受到母源基因的干扰，只能对特定的基因区 域或疾病进行遗传检测；
[0028] 5、普适性：通过提取纯化胎儿游离DNA或（和）RNA的方法，无法获得完整的胎 儿基因组，而且容易为母源基因污染，此方法目前只能用于胎儿性别的检测和特定基因的 检测，羊水穿刺及分离外周血游离DNA只能对单一特定遗传疾病进行遗传检测，而本发明 能获取源自胎儿的完整全基因组DNA，可进行大量的单个和全基因组水平上的各类基因 值NA)分析、单基因病诊断、个体药物耐受性、多基因病致病风险甚至细胞遗传学分析（染 色体缺失及微缺失、重复、易位等重组）等遗传诊断，无需为诊断不同的遗传病而设计不同 的遗传检测方案；
[0029] 6、本发明仅需要少数几个，或一个胎儿有核细胞就能完成胎儿基因组的提取，避 免了由于细胞数量不足导致的检测失败，不仅大大提高了产前检查的成功率，更节省了资 源消耗。
[0030] 本发明可精确获得胎儿来源的全基因组DNA，为无创性产前遗传诊断应用奠定了 物质基础，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
[0031] W下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，W下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0032] W下实施例中母亲和/或父亲的体细胞来源自但不限于；头皮屑、口腔上皮、孕前 母亲的外周血等。
[0033] W下实施例中鉴定胎儿特有或父源特有（母源无）遗传标记的方法包括但不限 于基因芯片法、PCR测序法、MGB英光PCR法、限制性片断长度多态性法、单链构象多态性 法、变性梯度凝胶电泳法、飞行质谱仪检测法、变性高效液相色谱法等。
[0034] W下实施例中标记胎儿有核细胞的方法包括但不限于应用原位杂交技术，包 括单色英光原位杂交、多色英光原位杂交、DNA纤维英光原位杂交及英光原位杂交与 其他标记技术联合应用；标记探针包括使用生物素度iotin)、地高辛（digoxigenin)、 dinitrophenyl(DNP)、aminoacetylfluorine(AA巧等方法。
[0035] 室施包U、无创性获取胎儿完整基因组DNA的方法
[0036] 1. 1、母体外周血中单核细胞的分离
[0037] 取妊娠5~38周的母体（孕妇）外周静脉血5~20ml,优选妊娠10~17周， 最佳采血量为10ml，采用4mmol/L的邸TA抗凝，然后用磯酸盐缓冲液（PBS，pH7. 4) 按1;1稀释。在15ml的化Icon离必管内，加入5ml细胞分离液His化paque"-1077(Sigma公司），沿着离必管壁缓慢加入上述稀释的孕妇血10ml，使血液覆盖在细胞分离液 Histopaque'S-1077上，400 X g室温离必30min。吸取位于血浆和Histopaque?-】077之间的 单核细胞层，用PBS缓冲液（含5mmol/L邸TA和含体积分数为0. 5%的BSA，pH7. 4)洗涂 1次，W大约每1〇7个细胞加80μLPBS缓冲液（pH7. 4)的比例制成单核细胞悬液。
[003引1. 2、制备单核细胞涂片
[0039] 吸取有核细胞悬液20μ1混匀后加在显微切割带膜载玻片有膜面左端的膜上，沿 有膜区将细胞均匀涂在