作为鉴别潜在味觉调节剂的模型的细胞的制作方法
【专利说明】
[0001] 本公开内容中引用的每篇参考文献将其全部并入本文中。
[0002] 本申请按引用并入2014年5月5日形成的并且名称为 "056943. 01231sequencelisting.txt"的13. 7化文本文件，运是用于本申请的序列表。
技术领域
[0003] 本公开内容总地设及可W用于鉴别甜味感受器调节剂的细胞系和试验。
[0004] 附图简述
[000引图1A-B.对甜味化合物的化(W响应。图1A，使用（钻石）和未用（立角）T1R3/T1R2/GQ15激活的JUMP-IN?T-REX?U2-0S中Ca(W-释放的剂量响应曲线（η= 3次实 验）。图 1Β，lactisole和U73122 对JUMP-IN?T-REX?U2-0S细胞中的Ca(w响应的作用 (平均+SD)。
[0006] 图2.显示了Ga15蛋白对U2-0S响应lOOmMS氯薦糖的影响的图。用3、6和 12μ1/40, 000细胞的编码G蛋白，味蛋白（gustducin)(Gα15)的BacMam在24小时（左） 或48小时（右）过程中瞬时转染U2-0S细胞。
[0007] 图3.显示了lOOmM的天然糖（葡萄糖、果糖和薦糖）对用0或6μ1/40, 000细胞 的编码Gα15的BacMam转染的U2-0S的影响的图。
[000引 图4.显示了用lOOmM葡萄糖处理时U2-0S细胞中甜味感受器激活祀服1/2的图。 用lactisole(20mM，左条）处理U2-0S细胞阻断了D-葡萄糖介导的祀服1/2的激活。
[0009] 图5.证明了用Ga15化μ1/40, 000细胞）转染U2-0S细胞显著提高了祀服1/2 激活，其被化Cβ2抑制剂U73122 (10μΜ)阻断。
[0010] 图6.显示了用Ga15化μ1/40, 000细胞）转染的U2-0S细胞中用D-葡萄糖和麦 芽糖处理时祀服1/2激活的图。
[0011] 图7.显示了用Ga15化μ1/40, 000细胞）转染的U2-0S细胞中用不同的糖处理 时祀服1/2激活的图。
[001 引图8Α-Β. Transfluor试验。图8Α，用编码Ga 15的BacMam转染的Transfluor U2-0S细胞中绿色巧光泡囊的形成。用化echst 33342将核复染成蓝色。图8B，Transfluor 模型中T1R2/T1R3内化的定量（平均+SD)。
[0013]图9A-B.U2-0S细胞表达内源性甜味感受器T1R2/T1R3。图9A，将U2-0S细胞固定 并处理，用于使用对抗甜味感受器T1R2和T1R3的抗体的间接免疫巧光。使用ImageXpress Micro自动化显微镜，使用20x物镜，获取所有图像。化echst33342染色是假着色的蓝 色，并且抗体特异性染色是假着色的绿色。图9B.U2-0S和NCI-H716细胞中的T1R2的 Western印迹。将细胞在RIPA缓冲液巧OmMTris-肥 1pH7. 5,150mMNaCl，1%NP-40,5mM 邸TA，0. 1%SDS和10μg/ml蛋白酶抑制剂）中裂解。冻-融循环后，加入终浓度2x的加 样缓冲液，将样品在95°C下加热10分钟并且在最高速度下在RT下在微离屯、机中离屯、10 分钟。将上清液加载于凝胶上，用于通过免疫印迹分析。用于T1R2和GAPDH的一抗来自 ThermoFisher〇
[0014] 详述
[0015]T1R2和T1R3的共同表达形成响应甜味刺激物（包括天然产生的和人造甜味 剂）的味觉感受器。甜味配体结合T1R2/T1R3感受器并激活G-蛋白途径转导，其诱导感 受器内化和巧动员，W及下游祀标的诱导，如E服1/2的憐酸化（Jang等，"Gut-expressed gustdueinandtastereceptorsregulatesecretionofglue过gon-like p邱tide-1，"化ocNatlAcadSciUSA. 2007S邱 18 :104(38): 15069-74)。
[0016] 任何包含或可W工程化W包含功能性调味感受器的细胞可W用于所公开的试验 中。在一些实施方案中，细胞表达一种或多种甜味感受器。在一些实施方案中，细胞被遗 传修饰，W表达或超表达甜味感受器。例如，可W通过引入编码T1R2和T1R3的外源性核 酸或两个分开的分别编码T1R2和T1R3的外源性核酸来遗传修饰细胞。用于运些蛋白质 的氨基酸序列是已知的；例如，GenBank登记号NP_689418. 2灯1R2)和GenBank登记号 NP-689414. 1aiR3)。
[0017] 可W使用本领域公知的方法，将细胞工程化来表达T2R14、T1R2/T1R3、 α-gust化cin和/或GLUT4。其中，GLUT4描述于美国专利7, 799, 538和其中引用的参考 文献中。对于α-gust化cin的描述，参见美国专利8, 338, 115和其中引用的参考文献W及 Adler等，Cell100,693-702,2000。
[001引在一些实施方案中，将细胞遗传修饰来超表达α-gust化cin(例如，Ga 16、G曰15、Ga 16gust25、Ga 15gust25、Ga 16gust44、Ga 15gust44、Ga 15-i/3-5)，其提高试验 的灵敏度。SEQ ID N0:1是Ga 15的氨基酸序列。序列表中提供了可W用于表达Ga 16(SEQ ID N0:2)、Gal6gust25(SEQ ID N0:3)、Gal5(SEQ ID N0:4)、Gal5gust25(SEQ ID N0:5)、 G曰16gust44(沈Q ID N0:6)、G曰15gust44(沈Q ID N0:7)和G曰15-i/3-5(沈Q ID N0:8); 然而，编码运些a -gust化cin的任何核巧酸序列可W用于表达它们。
[0019] 在一些实施方案中，使用U2-0S细胞，如下所述。人U2-0S细胞（ATCC目录 #HTB-96)表达功能性甜味感受器（图9A-B)。因此，通过将U2-0S细胞接触测试化合物并 测量甜味感受器活性，肥-0S细胞可W用于检测对潜在甜味呈味剂（tastant)的细胞响应。 可W使用各种功能性试验，包括胞内巧浓度变化的测量（例如，基于巧光计成像平板阅读 器的Ca2+动员试验，FLIPR)、祀服1/2激活（例如，高含量成像，肥0和感受器内化（例如， transfluor)。在测试化合物的存在下通过甜味剂的甜味感受器活性的变化表明甜味感受 器受到测试化合物的调节，因此鉴别甜味调节剂（例如，其自身提供甜味的分子、阻断一些 或全部苦味的分子、增强另一种分子的甜味的分子）。甜味感受器活性的提高表明测试化合 物是甜味调节剂。甜味调节剂可W包括在各种消耗品，包括食品、饮料和药物中。
[0020] 可W用于所公开的试验中的其他细胞包括，但不限于，1A2, ARH-77, RWPE-1，WI-3 8, EJM, NCI-H1155,1^-1236, NCI-H526, JM1, SHP-77, SNU-878, NCI-肥196, C3A, CA46, SNU-46 6, KS-1, SNU-738, M0LP-2, HDLM-2, Pfeiffer,肥C-15, Alexander cells, 1^-540, KMS-12-BM ，JK-1, NCI-H1092, SW 1990, NCI-Hl 184,洲-0化-1，Hep 3B2. 1-7, P3HR-1, NCI-肥029,洲-DHL-5, SNU-1, MOLP-8, SUP-M2, MONO-MAC-1, SNU-1040, KYM-1,皿C-59, HCC1569, 0CI-LY3, Hs 819. T, DU4475, CI-1, S-117, OVCAR-8, SNU-626, HL-60, SlHT-2, T3M-4,服0, MOR/CPR, DK-MG, GA-10, OCUM-1,肥T-15, HT, MONO-MAC-6, G-402, Toledo, C0V362, SU-DH-S, Daoy, NCI-H 1435, LS513, Hs 839. T, Hs 172. T, BT-483, KMS-21BM, AGS, NCI-H2172, LC-l/sq-SF,SNU-20 1，NUGC-4, SK-肥P-1, SUP-B15, SNU-5, HT-1197, SUP-Tl, AMO-1, KU812, AN3CA, AMkl93, VMR C-RCW, HLE, Hu肥8, Hs 751. T, NCI-肥110, MEG-01, MV-4-11, Hep G2, KY沈-30, KALS-1, BICR 6, RMUG-S, JHH-6, Ki-化，IST-MESl,肥C-95, HPB-A化，HSC-3, 697, LOU-NH91, KARPAS-299, GI -1，COLO 792, SK-N-FI, D341Med,服C-27, SR-786, COLO-818, MHH-CA化-2, SF126, NCI-册22，A-253,NCI-H1623, MCF7, HCC-44, FU97, OCI-LY-19, Hs 766T,NCI-H522,化，HCC1428, RPMI 6666, U-937, NCI-H460, SW 1088, NCI-H1792,NCI-H1693, UACC-257, JHUEM-2, HuT78, UACC-893, NCI-册29, A-704, OV56, LN-229, OE19, SK-MEL-24,畑-ES, NCI-H211, KCI-MOHl, NCI-Hl 963, Hs 706. T, ChaGo-K-1, E化C-272H, OPM-2, KHM-IB, A549, HuGl-N, NCI-册08, MHH-CA化-3, SNU-1076, A3/KAW, TO 175. T, Caki-1, Hs 936. T, SK-LU-1, WM-983B, K-562, E阳- 184, SNU-520, NCI-H2291，HCC-1195, ABC-1, KE-39,畑-6,肥C2218, CMK, RS4 ;11，KYSE-450, OV7, KY沈-510,