一种制备低分子降压肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化技术领域，具体地说是以大豆分离蛋白液为原料，利用复合酶法制备低分子降压肽，即同时运用三种水解酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)来水解大豆分离蛋白，再将水解液通过活性炭吸附、超滤等纯化方法从中获取较纯的低分子大豆降压肽。
【背景技术】
[0002]高血压是一种常见的心血管疾病，它发病率高，常伴有心脏、血管、肺以及肾脏等器官功能性或器质性改变，是引发心、脑、肾和眼血管等各种并发症和导致中风、促进动脉粥样硬化、冠心病的一个重要危险因子。高血压发病率在发达国家达到20%以上，世界各国的平均发病率为10%?20%，且人群分布广，包括老年人、中年人和儿童全世界每年因高血压死亡的人数达1200万。我国曾进行了三次全国性的高血压普查，1959年的发病率是5.11 %, 1979?1980年发病率为7.73 %, 1990?1991年发病率为11.26 %。目前，我国现有高血压患者己超过1.2亿人口。因此，治疗和预防高血压病是当今社会十分重要的课题。
[0003]高血压一般有两种类型:原发性高血压和继发性的高血压，前者主要是由于周围小动脉血管口径变小或血液粘滞度增加，造成外用阻力过高所致；而血容量与心输出量的增高、血管的僵硬程度与血管的充盈程度均影响血压的变化；同时植物性神经系统对血压的调节作用也是一个重要因素。继发性的高血压，也叫症状性高血压，是在某些疾病过程中并发的血压升高，其成因主要有内分泌病、肾脏疾病、心脏功能异常等。
[0004]血管紧张素转化酶(ang1tensinconverting enzyme., ACE)是一种含锌的二肽酶，能被氯离子激活并具有较宽的底物特异性。ACE广泛分布在哺乳动物的组织中。在肾素一血管紧张素系统(renin-ang1tensin system, RAS)和激肽释放酶一激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)中，ACE对机体血压和心血管功能起着重要的调节作用。抑制ACE的活性被认为是治疗高血压的一种重要而有效的方法。目前，大量高效、特异的ACE抑制剂在治疗高血压病和充血性心力衰竭中发挥着重要作用。
[0005]食物蛋白来源丰富，方便易得，用食物蛋白来生产活性肽成本较低、安全性高、适合大规模生产。来源于食品的降压肽只对高血压患者起到降压的作用，对血压正常者无降压作用，不会产生降压过度的问题；这些肽用食用级的酶在温和条件下制得的，其安全性极高，无毒副作用；除了有降压的功能外，还同时具有抗氧化、促消化、降血糖、抗血小板凝集、增强人体免疫力等作用；具有较高的热稳定性、水溶性等优点，可作为功能因子添加到饮料、食品中去，市场前景极好。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是生产较纯的低分子大豆降压肽。
[0007]本发明的技术方案是:以大豆分离蛋白液为原料，利用复合酶法制备低分子降压肽，即同时运用三种水解酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)来水解大豆分离蛋白，再将水解液通过活性炭吸附、超滤等纯化方法从中获取较纯的低分子大豆降压肽。本发明具有工艺简单，操作安全，成本较低的特点，非常适用于规模化大生产。包括如下步骤:
(1)将底物浓度为4%?6%的大豆分离蛋白溶液在85°C水浴加热预处理15min?30min;
(2)待料液冷却到40°C?60 °C后，先加入E/S为6%?8%的碱性蛋白酶，pH 7.5?9.0条件下微波水浴加热10?20 min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S为8%?10%的中性蛋白酶，温度为50°C?60°C，pH7.5?9.0条件下酶解10?20 min ；
(4)最后再加入E/S为9%?11%的胰蛋白酶，温度为50°C?60°C，pH7.5?9.0条件下酶解15?30 min ；
(5)料液用4kDa?2kDa的超滤膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa对料液超滤30min?50min ；
(6)超滤透过液经沸水浴10?20min彻底灭酶处理后，再3000r?5000r/ min离心10?30min，收集上清液，真空冷冻干燥，即三酶水解大豆多肽。
【具体实施方式】
[0008]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0009]实施例1
以大豆分离蛋白液为原料，利用复合酶法制备低分子降压肽，即同时运用三种水解酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)来水解大豆分离蛋白，再将水解液通过活性炭吸附、超滤等纯化方法从中获取较纯的低分子大豆降压肽。包括如下步骤:
(1)将底物浓度为4%的大豆分离蛋白溶液在85°C水浴加热预处理20min;
(2)待料液冷却到40°C°(:后，先加入E/S为6%的碱性蛋白酶，pH 8.0条件下微波水浴加热10 min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S为8%的中性蛋白酶，温度为50°C，pH8.0条件下酶解10 min ；
(4)最后再加入E/S为9%的胰蛋白酶，温度为50°C，pH8.0条件下酶解15 min ；
(5)料液2kDa的超滤膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa对料液超滤30min;
(6)超滤透过液经沸水浴lOmin彻底灭酶处理后，再3000r/ min离心lOmin，收集上清液，真空冷冻干燥，即三酶水解大豆多肽。
[0010]实施例2
(1)将底物浓度为5%的大豆分离蛋白溶液在85°C水浴加热预处理20min;
(2)待料液冷却到50°C后，先加入E/S为7%的碱性蛋白酶，pH8.5条件下微波水浴加热15min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S为9的中性蛋白酶，温度为55°C，pH8.5条件下酶角军15min ；
(4)最后再加入E/S为10%的胰蛋白酶，温度为55°C，pH8.5条件下酶解20 min ;
(5)料液用3kDa的超滤膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa对料液超滤40min ; (6)超滤透过液经沸水浴15min彻底灭酶处理后，再4000r / min离心20min，收集上清液，真空冷冻干燥，即三酶水解大豆多肽。
[0011]实施例3
(1)将底物浓度为6%的大豆分离蛋白溶液在85°C水浴加热预处理30min;
(2)待料液冷却到60°C后，先加入E/S为8%的碱性蛋白酶，pH9.0条件下微波水浴加热20 min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S为10%的中性蛋白酶，温度为60°C，pH9.0条件下酶解20 min ；
(4)最后再加入E/S为11%的胰蛋白酶，温度为60°C，pH9.0条件下酶解30
min ；
(5)料液用4kDa的超滤膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa对料液超滤50min;
(6)超滤透过液经沸水浴20min彻底灭酶处理后，再5000r/min离心30min，收集上清液，真空冷冻干燥，即三酶水解大豆多肽。
[0012]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.一种制备低分子降压肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)将底物浓度为4%?6%的大豆分离蛋白溶液在85°C水浴加热预处理15min?30min; (2 )待料液冷却到40 °C?60 °C后，先加入E/S为6%?8%的碱性蛋白酶，pH 7.5?9.0条件下微波水浴加热10?20 min; (3)酶解后的料液中再加入E/S为8%?10%的中性蛋白酶，温度为50°C?60°C，pH7.5?9.0条件下酶解10?20 min ； (4)最后再加入E/S为9%?11%的胰蛋白酶，温度为50°C?60°C，pH7.5?9.0条件下酶解15?30 min ； (5)料液用4kDa?2kDa的超滤膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa对料液超滤30min?50min ； (6)超滤透过液经沸水浴10?20min彻底灭酶处理后，再3000r?5000r/ min离心10?30min，收集上清液，真空冷冻干燥，即三酶水解大豆多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，大豆分离蛋白溶液的浓度为4%?6%，在85°C水浴加热预处理15min?30min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，在温度为40°C?60°C，pH7.5?9.0条件下，先加入E/S为6%?8%的碱性蛋白酶，微波水浴加热10?20 min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，在温度为50°C?60°C，pH7.5?9.0条件下再加入E/S为8%?10%的中性蛋白酶，酶解10?20 min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，温度为50°C?60°C，pH7.5?9.0条件下，最后再加入E/S为9%?11%的胰蛋白酶酶解15?30 min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(5)中，料液用8kDa?4kDa的超滤膜于 40 °C，0.1MPa ?0.2MPa 对料液超滤 30min ?50min。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(6)中，超滤透过液经沸水浴10?20min彻底灭酶处理后，再3000r?5000r / min离心10?30min，收集上清液，真空冷冻干燥，即三酶水解大豆多肽。
【专利摘要】本发明公开了一种制备低分子降压肽的方法。本发明的技术方案是以大豆分离蛋白液为原料,利用复合酶法制备低分子降压肽,即同时运用三种水解酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)来水解大豆分离蛋白,再将水解液通过活性炭吸附、超滤等纯化方法从中获取较纯的低分子大豆降压肽。本发明具有工艺简单，操作安全，成本较低的特点，非常适用于规模化大生产。
【IPC分类】C07K1/34, C12P21/06
【公开号】CN105368903
【申请号】CN201510826578
【发明人】刘乃山, 宋立明, 刘翠珍
【申请人】青岛康原药业有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月25日