分化细胞的新型制备方法
【专利说明】
[0001] 本发明专利申请是中国专利申请号为201080042161. 7 (PCT申请号为PCT/ JP2010/065903)、申请日为2010年9月15日、发明名称为"分化细胞的新型制备方法"的 发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种制备特定的分化细胞的方法以及根据该方法制备的细胞。尤其， 本发明涉及一种制备分化的血球细胞的方法以及根据该方法制备的血球细胞。
【背景技术】
[0003] 在为了治疗患者而需要特定的细胞时，需要确保能够达到治疗目的的充足数量的 细胞。然而，由于从机体获取用于治疗的充足量的细胞较为困难，因此尝试了在机体外例如 从其前体细胞等分化诱导目的细胞而制备的方法等。
[0004] 在治疗与血液相关的疾病时，或者在进行外科治疗时，需要用于治疗的血球细胞。 在血球细胞中，尤其血小板、前血小板（proplatelet)作为血液凝固（止血）所必须的细 胞，进一步地巨核细胞作为产生血小板的细胞，是需求特别大的细胞。特别是血小板在白血 病、骨髓移植、抗癌治疗等方面需要的量较多，且稳定供给的必要性高。迄今为止，为了确 保血小板的供给，除了通过从献血者的血液中提取的方法外，采用了给予如TPO的类似物 (mimetics)制剂的方法、从脐带血或骨髓细胞分化出巨核细胞的方法等。进一步地，尝试 了在机体外扩增造血干细胞或造血前体细胞，从这些前体细胞制备血球细胞的方法等。例 如，目前报道有从小鼠 ES细胞建立造血干细胞株的方法（专利文献1)、从灵长类动物的胚 胎干细胞向造血细胞分化的方法（专利文献2)或者在机体外简便且稳定地扩增维持造血 干细胞的未分化性的CD34阳性/CD38阴性细胞的方法（专利文献3)等。
[0005] 并且，在分化诱导细胞时，多功能干细胞的有用性很高。ES细胞和iPS细胞等多功 能干细胞能够作为人工制备血小板等血球细胞的来源（source)而利用。近年来，由于iPS 细胞的建立，多功能干细胞的有用性在再生医疗中作为细胞疗法的重要来源而进一步受到 了关注。迄今为止，例如Takayama等人成功地从人类ES细胞分化诱导出巨核细胞以及血小 板，其结果，出现了作为血小板输血源而利用从ES细胞分化的血小板的可能性（专利文献 4以及非专利文献1)。进一步地，发明者们已确立从iPS细胞制备巨核细胞以及血小板的 方法，可以解决在ES细胞来源的血小板的输血中难以回避的白血球抗原（human leukocyte antigen，HLA(人类白细胞抗原））的相容性问题。并且，以往，对于从献血者的血液提供的 血小板而言，由于献血人数的持续不足等而难以稳定地供给充足的血小板，对于该问题，也 认为可以通过从ES细胞或者iPS细胞分化诱导血小板而解决。但是，在迄今为止的方法中， 从iPS细胞或者ES细胞制备的血小板由于制备量较少，且每次制造时都要通过一系列工艺 才能制备，因此目前期望将以往的方法改善成确保血小板量的稳定性的有效的方法。
[0006] 为了稳定地提供充足的这种巨核细胞和血小板等血球细胞而需要解决的问题，可 以说在其他细胞的供给中也存在。
[0007] 在通过细胞分化诱导而制备期望的细胞时，同样由于不容易大量制备期望的细胞 的前体细胞，因此在目前阶段，最终难以确保充足量的分化的期望细胞。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1 :日本特开2006-141356号公报
[0011] 专利文献2 :日本特开2004-350601号公报
[0012] 专利文献3 :日本特开2006-61106号公报
[0013] 专利文献 4 :TO2008/041370
[0014] 非专利文献
[0015] 非专利文献 I :Takayama 等，Blood, 111:5298-53062008
【发明内容】
[0016] 技术问题
[0017] 虽然本发明的发明者们已确立关于血球细胞的从iPS细胞获得巨核细胞以及血 小板的方法，但是在将该方法临床应用时，需要改善成能够大量产生巨核细胞以及血小板 的方法。并且，如果着眼于将来的临床应用，则能够迅速应对血小板的供应需要，并且可以 进行稳定的供应，也是重要的因素。
[0018] 因此，鉴于上述方面，本发明提供一种方法，该方法为了通过分化诱导细胞而制备 目的细胞，提高处于期望的分化阶段的细胞的增殖能力，扩增细胞数，从该细胞制备目的细 胞。
[0019] 进一步地，本发明通过使用上述方法而提供期望的分化的血球细胞。尤其，本发明 提供成为成熟巨核细胞和血小板来源（source)的、作为血球细胞的、增殖能力高的巨核前 体细胞及其制备方法。
[0020] 并且，本发明的目的在于，提供从该巨核前体细胞大量且稳定地制备成熟巨核细 胞和血小板的方法，以及通过这些方法制备的成熟巨核细胞以及从该成熟巨核细胞分化诱 导的血小板。
[0021] 并且，由于对于红血球细胞也指出了与血小板同样地稳定供给的必要性，因此提 供红血球细胞的制备方法以及通过该方法制备的红血球，也作为本发明的目的。
[0022] 进一步地，本发明的目的在于，提供一种长期保藏作为成熟巨核细胞的未成熟状 态的细胞的巨核前体细胞的方法，该成熟巨核细胞作为血小板的前体细胞。
[0023] 技术方案
[0024] 发明者们比较通过四种基因（0ct3/4, S0X2, KLF-4, c-MYC)建立的iPS细胞和通 过除了 c-MYC的三种基因（0ct3/4，S0X2，KLF-4)建立的iPS细胞的巨核细胞以及血小板产 生能力，明确了通过四种基因的iPS细胞更有意义且有效地产生巨核细胞以及血小板。进 一步地，明确了建立时导入的四种基因的表达虽然在iPS细胞状态下被抑制，但是伴随巨 核细胞的分化，诱导了 c-MYC基因的再活化，参与巨核细胞的产生量的增加。进一步地，还 明确了使c-MYC基因强制性表达的多核化前的巨核前体细胞获得高的增殖能力。
[0025] 并且，一般使c-MYC等癌基因在细胞中过表达时，会加快细胞周期，使增殖活跃进 行。已知，细胞对该增殖作为压力而捕获，诱导抑制该增殖的防御反应（oncogene-induced senescence，OIS :癌基因诱导性细胞衰老），抑制过剩的细胞增殖。本发明的发明者等人进 一步着眼于该现象，发现通过调控处于分化阶段的细胞的OIS而大量制备特定分化的细胞 的方法。
[0026] 本发明是基于以上见解而完成的。
[0027] BP，本发明涉及以下⑴~（30)。
[0028] (1) -种特定细胞的制备方法，该方法是分化诱导细胞而制备特定细胞的方法，其 中，为了扩增期望的分化阶段的细胞，在该期望的分化阶段的细胞内使癌基因强制表达。
[0029] (2)如上述（1)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，抑制由于在期望的分化 阶段的细胞内使癌基因强制表达而诱导的、癌基因诱导性细胞衰老。
[0030] (3)如上述⑴或⑵所述的特定细胞的制备方法，所述癌基因诱导性细胞衰老的 抑制是通过使多梳基因表达而实现的。
[0031] (4)如上述（1)至（3)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述 期望的分化阶段的细胞是从胚胎干细胞或者诱导多能干细胞分化诱导的细胞。
[0032] (5)如上述（1)至（4)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，在所 述期望的分化阶段的细胞内，导入外源癌基因、或者癌基因以及多梳基因，使该癌基因、或 者该癌基因以及该多梳基因强制表达。
[0033] (6)如上述（5)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，在期望的分化阶段的细 胞的前体细胞中导入所述外源癌基因或者多梳基因，使该癌基因、或者该癌基因以及该多 梳基因强制表达。
[0034] (7)如上述（5)或（6)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，将所述癌基因和 /或多梳基因分别可发挥作用地连接到诱导型启动子的下游，使该癌基因、或者该癌基因以 及该多梳基因诱导性强制表达。
[0035] (8)如上述（5)至（7)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，为了 促进所述期望的分化阶段的细胞的分化，抑制该期望的分化阶段的细胞内的癌基因或者、 癌基因以及多梳基因的表达。
[0036] (9)如上述（8)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述癌基因、或者癌基 因以及多梳基因的表达抑制是，通过分别可发挥作用地连接到抑制型启动子的下游，抑制 该基因表达而实现的。
[0037] (10)如上述⑴至（9)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述 癌基因为MYC家族基因。
[0038] (11)如上述（3)至（10)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所 述多梳基因为BMIl基因。
[0039] (12)如上述（6)至（11)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所 述期望的分化阶段的细胞的前体细胞是造血前体细胞，所述期望的分化阶段的细胞是多核 化前的巨核前体细胞，所述特定细胞是成熟巨核细胞。
[0040] (13)如上述（6)至（11)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所 述期望的分化阶段的细胞的前体细胞是造血前体细胞，所述期望的分化阶段的细胞是多核 化前的巨核前体细胞，所述特定细胞是血小板。
[0041] (14)如上述（12)或（13)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述造血前体 细胞是存在于从胚胎干细胞或者诱导多能干细胞制备的网状结构物内的细胞。
[0042] (15) -种成熟巨核细胞，该成熟巨核细胞是如上述（12)或（14)所述的特定细胞。
[0043] (16) -种血小板，该血小板是如上述（13)或（14)所述的特定细胞。
[0044] (17) -种血液制剂，该血液制剂将记载于上述（16)的血小板作为有效成分。
[0045] (18) -种试剂盒，用于制备如上述（15)或（16)所述的成熟巨核细胞或者血小板。
[0046] (19) -种强制表达癌基因的期望的分化阶段的血球细胞。
[0047] (20)如上述（19)所述的血球细胞，进一步强制表达多梳基因。
[0048] (21)如上述（19)或（20)所述的血球细胞，其特征在于，所述期望的分化阶段的血 球细胞是从胚胎干细胞或者诱导多能干细胞分化诱导的细胞。
[0049] (22)如上述（19)至（21)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，在所述期望的 分化阶段的血球细胞内，导入外源癌基因、或者癌基因以及多梳基因，使癌基因、或者癌基 因以及多梳基因强制表达。
[0050] (23)如上述（22)所述的血球细胞，其特征在于，将所述外源癌基因或者多梳基因 导入到期望的分化阶段的血球细胞的前体细胞内，使该癌基因、或者该癌基因以及该多梳 基因强制表达。
[0051] (24)如上述（22)或（23)所述的血球细胞，其特征在于，将所述癌基因和/或多梳 基因分别可发挥作用地连接到诱导型启动子的下游，使该癌基因、或者该癌基因以及该多 梳基因诱导性强制表达。
[0052] (25)如上述（19)至（24)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，所述癌基因为 MYC家族基因。
[0053] (26)如上述（20)至（25)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，所述多梳基因 为BMIl基因。
[0054] (27)如上述（23)至（26)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，所述期望的分 化阶段的血球细胞的前体细胞是造血前体细胞，所述期望的分化阶段的血球细胞是多核化 前的巨核前体细胞。
[0055] (28)如上述（27)所述的血球细胞，其特征在于，所述造血前体细胞是存在于从胚 胎干细胞或者诱导多能干细胞制备的网状结构物内的细胞。
[0056] (29) -种冷冻细胞组合物，包含