用于培养铁皮石斛褐斑病菌的含有特异糖源的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，特别的，属于采用培养方法来培养铁皮石斛褐斑病菌的 培养方法。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛（DendrobiumSw.)又名黑节草、云南铁皮，是兰科（Orchidaceae)多年 生附生草本植物，是一种珍贵的中药材。早在《神农本草经》中就有记载，具有滋阴清热、生 津益胃、润肺止咳、明目强身、镇痛消炎的功效。同时现代研究表明，石斛药材除具有本草记 载的等功效外，还具有抗肿瘤、抗辐射、抗血小板凝集及增强机体免疫力等功效。近年来石 斛药材的需求量不断增加，而栽培技术的不断创新使得人工种植石斛的面积不断增大，然 而随着集中种植面积的增加，出现的问题也不断增多，石斛种植出现多种不同的病害，例如 铁皮石斛褐斑病。石斛叶片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小点，后小点渐渐扩大为约 5~6mm的病斑。这不仅影响石斛的品质，也影响石斛的产量，具统计褐斑病导致产量损失 5% -10%。防止褐斑病的发生和扩增有助于提高石斛生产的产量和品质，确保石斛产业健 康有序的发展。为了研究如何防治铁皮石斛的褐斑病，就需要首先培养褐斑病来进行一些 方面的研究，例如研究该病菌的生物学特性，药效试验等筛选出合适的药物进行防治。但 是，这种病菌难以培养，而且产量低，为此，需要提供如何高效率的培养褐斑病病菌进行相 关方面的研究。
【发明内容】
[0003] 为了解决以上问题，本发明提供一种培养铁皮石斛褐斑病菌的方法，该方法包括： 提供草莓煎汁培养基，其中该草莓煎汁培养基的组成为：草莓茎叶200g，蔗糖20g，琼脂 20g，添加水至1000ml。
[0004] 优选的，草莓茎叶200g经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和 200g草莓茎叶，煮沸5min后，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0005] 优选的，培养的PH值为7.
[0006] 优选的，培养的温度为25-30摄氏度。
[0007] 优选的，所述的铁皮石斛褐斑病菌为多喙茎点霉（Phoma multirostrata(Mathuretal. )Dorenboseh&Boerema)〇
[0008] 另一方面，本发明提供草莓煎汁培养基在制作培养铁皮石斛褐斑病菌培养基中的 用途，其中所述的草莓煎汁培养基由下列组分组成：草莓茎叶200g，蔗糖20g，琼脂20g。
[0009] 优选的，优选的，草莓莖叶200g经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸 馏水和200g草莓茎叶，煮沸5min，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0010] 优选的，培养的PH值为7。
[0011] 优选的，培养的温度为25-30摄氏度。
[0012] 优选的，所述的铁皮石斛褐斑病菌为多喙茎点霉（Phoma multirostrata(Mathuretal. )Dorenboseh&Boerema)〇
[0013] 另一方面，本发明提供一种培养铁皮石斛褐斑病菌的方法，该方法包括提供一种 培养基，该培养的组成如下：氮源化合物3g，磷酸氢二钾lg，硫酸镁（MgS04 · 7H20)0. 5g，氯 化钾0. 5g，硫酸亚铁0.Olg，糖源物质30g，琼脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物质 为麦芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纤维乙糖。
[0014] 优选的，糖源物质为纤维乙糖。
[0015] 优选的，所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝 酸钾。
[0016] 优选的，所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸。
[0017] -种培养基在用于制备培养铁皮石斛褐斑病菌培养基中的用途，其中，所述的培 养基的组成如下：氮源（氨基酸）化合物3g，磷酸氢二钾lg，硫酸镁（1%304*7!120)0.58，氯 化钾0. 5g，硫酸亚铁0. 01g，糖源物质30g，琼脂20g，其中所述的糖源物质为麦芽糖、蔗糖、 菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纤维乙糖。
[0018] 优选的，糖源物质为纤维乙糖。
[0019] 优选的，所述的氨基酸化合物为L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。
[0020] 优选的，所述的氨基酸化合物为L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸。
[0021] 优选的，所述的铁皮石斛褐斑病菌为多喙茎点霉（Phoma multirostrata(Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)。
[0022] 有效效果
[0023] 通过本发明的特异培养基和培养方法，可以获得优质、大量的褐斑病菌，为研究褐 斑病菌提供了有益的材料，特别是可以提供大量的孢子。
[0024] 具体实施例子
[0025]1材料与方法
[0026] 1. 1铁皮石斛褐斑病病样采集及病原菌的分离
[0027] 田间铁皮石斛褐斑病病样采集于浙江省乐清县雁荡山镇的乐清铁楓堂铁皮石斛 基地、乐清同丰铁皮石斛基地、乐清灵岩铁皮石斛基地；采样后将标样放入保鲜袋带回实验 室置于5°C冰箱，待用。切取铁皮石斛褐斑病镜检并用PSA培养基分别于进行常规组织分离 和划线分离。1.2致病性测定
[0028] 分别采用分离自铁皮石斛褐斑病病样分离物的菌丝和分生孢子液（稀释成IX106 个/mL)，对石斛进行嫩枝活体伤口和无伤接种，在25°C的XT5401-⑶275TJH智能生物人工 气候箱内，RH98%以上，12小时光照12小时黑暗接种后培养，以健康的枝条为对照，重复3 次，每天定时观察记录发病情况，分析致病性。
[0029] 1. 3病原菌的培养性状
[0030] 病原菌接种于PSA上于25°C培养7d，记录菌落形态，颜色；测量100个分生孢子的 大小，重复3次，记录平均值。
[0031] 1. 3. 1不同培养基对铁皮石斛褐斑病病原菌菌丝生长及分生孢子产生的影响。
[0032] 病原菌于25°C用下表中的培养基培养，每处理重复6次，5d后测量菌落直径，菌丝 干重、分生孢子器的产生情况、及其菌落色泽等。
[0033]表1:不同培养基的配方
[0034]
[0035] *煎汁培养基的准备过程：在煎锅中放入lOOOmL蒸馏水和200g相应的物品，煮沸 5min后，过滤留滤液，加入20g鹿糖，定容至1000mL。
[0036] 1. 3. 2,针对最优选的培养基（草莓煎汁培养基），我们确定不同pH值对铁皮石斛 褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响将直径4. 0mm的菌丝块移于pH值4-12的不同pH值 的草莓煎汁培养基上（pH值采用PHS-9V酸度计测量配制），置于25°C培养，每处理重复6 次，6d后测量菌落干重，计算分生孢子数量。
[0037] 1. 3. 3不同温度对铁皮石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响将直径4. 0mm的 菌丝块移于草莓煎汁培养基平板上，置于5°C，10°C，15°C，20°C，25°C，30°C，35°C不同温 度下培养，每处理重复6次，6d后测量菌落直径和分生孢子数量。
[0038]1. 3. 4不同碳源对铁皮石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响。
[0039] 经过我们的大量研究，发现，当以草莓煎汁培养基来研究最佳碳源和氮源对该病 菌培养的影响的时候，发现不同的碳源对培养的性状（菌落干重和产孢情况）并没有实质 的差异，也就是说不同的碳源或氮源似乎起到同样的作用，没有实质的改善和影响，同样， 在其他类似的培养基上，例如树皮煎汁培养基，甘蔗煎汁培养基，荷叶煎汁培养基，燕麦培 养基（0MA培养基）获得与草莓煎汁培养基类似的结果（具体数据略）。
[0040] 相反，查氏培养基为基础培养基，再分别用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、可溶淀粉、半乳 糖、海藻糖、甘露醇、木糖、DEAE纤维素、乙醇、核糖、果糖、山梨糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、 乳糖、麦芽糖、纤维素钠、纤维乙糖等20种不同碳源等量置换蔗糖（含量与蔗糖一样），于 25°C下培养，每处理重复6次，6d后测量菌落直径，观察菌落干重和产孢情况，获得了不同 的结果，具体见结果分析。
[0041] 1. 3. 5不同氮源对铁皮石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响。
[0042] 以查氏培养基为基础培养基，分别用谷氨酸、谷氨酰氨、天门冬酰氨、天门冬氨酸、 甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、酪氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨 酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-丙 氨酸、酪蛋白水解物、尿素、硫酸铵、硝酸钾、亚硝酸钠等26种氮源等量置换硝酸钾或硝酸 钠（质量与硝酸钾一样），置于25°C培养，每处理重复6次，6d后测量菌落直径，观察菌落干 重和产孢情况。
[0043] 2. 0结果与分析
[0044] 2. 1铁皮石斛褐斑病的症状
[0045] 褐斑病仅侵染铁皮石斛的叶片。叶片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小点，后 小点渐渐扩大，最大病斑约5~6mm。病斑圆形或椭圆形，淡褐色至黑褐色，有时病健交界处 常有一圈褐色的晕圈。病斑中间凹陷。严重时，叶片上出现许多大小不一的病斑，一般新叶 不染病。
[0046] 2. 2病原菌的分离和致病性测定
[0047] 对几十个石斛褐斑病标样进行划线分离和常规组织分离，5d后，培养皿上长出少 量细菌和不同的真菌，将这些细菌和真菌置于适宜的温湿度条件下对在相同铁皮石斛健康 的枝叶进行柯赫法则检验，发现这些细菌大都为芽孢杆菌，均为非致病菌；其中重复分离到 的一种真菌分离物为疑似病原物。将这种真菌分离物置于适宜的温湿度条件下在相同铁皮 石斛健康的枝叶进行接种检验，这些真菌分离物均对石斛叶致病，发病病症与田间基本一 致，通过分子生物方法鉴定为即为石斛褐斑病病原菌。
[0048] 2. 3病原菌分离物的形态及培养性状
[0049] 病原菌在PSA上，菌丝成放射状生长，气生菌丝灰白色，短绒毛状，较发达。平铺于 培养基上，初期菌落（尤其在其边缘）为淡淡的粉红色，随即转为灰色，再由灰色转为褐色， 最后由褐色转为黑褐色，菌落也成为碳质，培养皿背面呈黑褐色