一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物发酵的菌种制备及培养方法，具体涉及一种吉他霉素工业化生产 菌种的制备方法。
【背景技术】
[0002] 吉他霉素属大环内酯类抗生素，是一种抗菌药，对革兰氏阳性细菌和阴性细菌、立 克次氏体、螺旋体和大型病毒有较强的抑菌作用，并且对部份大环内酯类耐药菌也有效;抗 菌谱虽与红霉素相似，但不产生诱导耐药，细菌形成耐药较慢，是一种较好的抗生素替代品 种，广泛应用于抗青霉素的葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌感染，同时，在欧美和日本等国吉 他霉素也常作为饲料添加剂使用，也是我国农业部《饲料药物添加剂使用规范》I类药物中 明确规定可以使用的一种大环内酯类抗生素。目前，吉他霉素种子的制备工艺普遍采用新 鲜斜面孢子接种子摇瓶培养再进种子罐培养，由于新鲜斜面孢子在保藏过程中，孢子活力 会发生变化，受保藏时间限制，一次不可能制备太多斜面备用，这种工艺制备的种子生长周 期不稳定，批次更换频繁，造成了吉他霉素发酵水平的不稳定。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法。
[0004] 基于上述目的，本发明采取如下技术方案： 一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，包括如下步骤： a) 单菌落制备:将吉他霉素菌种加入0.5-1.OmL无菌生理盐水，震荡均匀，制成菌悬液， 接种针蘸取，在分离平板上划线，在26-30°C平板培养6-12天，得到单菌落； b) 斜面孢子制备:取步骤a)制备的单菌落均匀涂布到斜面上，在26-30°C斜面培养6-12 天； c) 冻干菌种管制备:在无菌条件下用接种环将斜面孢子刮下，用冷冻真空干燥法制成 冻干菌种管，在4°C保藏； d) 牛奶冷冻管制备:将步骤c)制备冻干菌种管开封，加入0.5-1.OmL无菌生理盐水，震 荡均匀，制成菌悬液，接种环蘸取均匀涂布到斜面上，在26-30°C斜面培养6-12天，在无菌条 件下用接种环将斜面孢子刮下，加入l〇_25wt%的脱脂牛奶水溶液2mL，分装0.2mL到容量为 2.OmL的菌种保藏管中得到孢子牛奶冷冻管，在-20°C~-80°C保藏； e) 进罐种子制备:取步骤d)制备的孢子牛奶冷冻管接入种子摇瓶培养基中，置于26-30 〇C的 摇床上培养24-48h，料液外观呈棕褐色，镜检菌丝粗壮，染色深，网状，即可进入种子罐 培养。
[0005] 进一步地，步骤a)中平板培养所用培养基的配方为:可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母 浸膏0 · 1-0 · 8wt%，硫酸镁0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氢钾0 · 025-0 · 075wt%，琼脂粉 1 · 5-2.5wt%，余量为水。
[0006] 步骤b)和步骤d)中斜面培养所用培养基的配方为：可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母 浸膏0 · 1-0 · 8wt%，硫酸镁0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氢钾0 · 025-0 · 075wt%，琼脂粉 1 · 5-2.5wt%，余量为水。
[0007] 步骤e)所述种子摇瓶培养基的配方为:淀粉1.5-2.5wt%，黄豆饼粉1.0-2.Owt%，氯 化钠0 · 2-1 ·Owt%，葡萄糖0 · 5-2 · 5wt%，蛋白胨0 · 25-1 ·Owt%，酵母粉0 · 1-0 · 6wt%，硫酸铵0 · 1-1 ·Owt%，硫酸镁0 · 01-0 · 05wt%，磷酸二氢钾0 · 01-0 · 05wt%，余量为水，灭菌前20wt%氢氧化钠 溶液调pH至6.8-7.5，120°C灭菌30min，加入占该培养基质量0.2-0.8%的碳酸钙，搅匀、分 装，每500mL三角瓶中装50mL培养基。
[0008] 与现有技术相比，本发明所述方法制备的吉他霉素工业化生产菌种摇瓶种子生长 周期在24小时左右，解决了采用传统菌种制备方法制得菌种在种子瓶生长周期时长时短、 不固定的问题。因为在生产过程中，各工序基本是按照固定时间进行工作，如果种子生长周 期不固定，就会影响发酵罐周期及后面工序的运行，给生产带来不便。如果菌种批次变动太 频繁，每批次种子间差异或同一批次前后不均一，会造成生产波动。本发明技术方案首先通 过单菌落的挑选过程使种子得到纯化;进一步通过斜面的培养过程，使种子的生长得到同 步化;经过制作成牛奶冷冻管保藏，避免新鲜斜面保存时间段，同一批次前后不均一情况发 生。
【具体实施方式】
[0009] 本发明实施例使用的吉他霉素菌种为吉他链霉菌甘露糖变种，为四川抗菌素研究 所提供的吉他霉素生产菌。
[0010] 实施例1 一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，包括如下步骤： a) 单菌落制备:将初始吉他霉素菌种管开封，加入0.5mL无菌生理盐水，震荡均匀，制 成菌悬液，接种针蘸取，在分离平板上划线，置于28°C恒温室中平板培养9天，得到单菌落； b) 斜面孢子制备:取步骤a)制备的单菌落均匀涂布到斜面上，28°C恒温室中斜面培养 9天； c) 冻干菌种管制备:取步骤b)制备的斜面孢子，在无菌条件下用接种环将斜面孢子刮 下，用冷冻真空干燥法制备冻干菌种管，贴上标签，写好日期、批号，置于4°C冰箱中保藏； d) 牛奶冷冻管制备:将步骤c)制备冻干菌种管开封，加入0.5mL无菌生理盐水，震荡均 匀，制成菌悬液，接种环蘸取均匀涂布到斜面上，28°C恒温室中斜面培养9天，在无菌条件 下用接种环将斜面孢子刮下，加入20wt%的脱脂牛奶水溶液2mL，分装0.2mL到容量为2.OmL 的菌种保藏管中得到孢子牛奶冷冻管，贴上标签，写好日期，批号，置于_80°C低温冰箱中保 藏； e) 进罐种子制备:取步骤d)制备的孢子牛奶冷冻管接入种子摇瓶培养基中，置于28°C、 振幅25mm、转速230rpm的摇床上培养32h，料液外观呈棕褐色，镜检菌丝粗壮，染色深，网状， 即可进入种子罐培养。
[0011] 进一步地，步骤a)中平板培养所用培养基的配方为:可溶性淀粉1.5wt%，酵母浸膏 0.4wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，琼脂粉1.8wt%，余量为水;装液量:容量500mL三角瓶装100mL培养基，灭菌前20wt%氢氧化钠水溶液调pH至7.4，120°C灭菌30min，灭菌后 置无菌室，待培养基温度降至50.0°C时，在洁净工作台上倒入空消好的双碟内，每碟倒入培 养基30mL，使均匀分布，凝固。
[0012]步骤b)和步骤d)所述斜面培养所用培养基的配方为:可溶性淀粉1.5wt%，酵母浸 膏0.4wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，琼脂粉1.8wt%，余量为水；装液量：容量 500mL三角瓶装100mL培养基，20wt%氢氧化钠水溶液调pH至7.4，120°C灭菌30min，灭菌后置 无菌室，待培养基温度降至50.0°C时，在洁净工作台上倒入空消好的双碟内，每碟倒入培养 基30mL，使均匀分布，凝固。
[0013]步骤e)所述种子摇瓶培养所用培养基的配方为:淀粉2.Owt%，黄豆饼粉1.8wt%，氯 化钠0.5wt%，葡萄糖0.8wt%，蛋白胨0.3wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸铵0.4wt%，硫酸镁0.03wt%， 磷酸二氢钾〇.〇3?^%，碳酸妈0.6?^%，余量为水，灭菌前20?^%氢氧化钠水溶液调？!1至7.4， 120°C灭菌30min，加入占该培养基质量0.5%的Ca⑶3，搅匀、分装，每500mL三角瓶中装50mL 培养基。
[0014] 按传统菌种制备方式:取用冷冻真空干燥法制备冻干菌种管开封，不经过单菌落 制备，直接制作斜面孢子保藏备用。按照传统方式制备的菌种和实施例制得的菌种经过不 同时间保藏，考察达到工艺要求的种子生长周期见表1。
[0015] 表1不同制备方法制备的种子对种子生长周期的影响
从上表中可以看出，使用本发明制备的菌种接种后，达到目标值种子生长周期稳定，经 长时间保藏，没有发生变化，而传统菌种制备的斜面菌种在使用过程中要延长种子培养周 期，且超过25天以后，就不能使用，必须更换批次。
【主权项】
1. 一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 单菌落制备:将吉他霉素菌种加入0.5-1.OmL无菌生理盐水，震荡均匀，制成菌悬液， 接种针蘸取，在分离平板上划线，在26-30°C平板培养6-12天，得到单菌落； b) 斜面孢子制备:取步骤a)制备的单菌落均匀涂布到斜面上，在26-30°C斜面培养6-12 天； c) 冻干菌种管制备:在无菌条件下用接种环将斜面孢子刮下，用冷冻真空干燥法制成 冻干菌种管，在4°C保藏； d) 牛奶冷冻管制备:将步骤c)制备冻干菌种管开封，加入0.5-1.OmL无菌生理盐水，震 荡均匀，制成菌悬液，接种环蘸取均匀涂布到斜面上，在26-30°C斜面培养6-12天，在无菌条 件下用接种环将斜面孢子刮下，加入l〇_25wt%的脱脂牛奶水溶液2mL，分装0.2mL到容量为 2.OmL的菌种保藏管中得到孢子牛奶冷冻管，在-20°C~-80°C保藏； e) 进罐种子制备:取步骤d)制备的孢子牛奶冷冻管接入种子摇瓶培养基中，置于26-30 〇C的 摇床上培养24-48h，料液外观呈棕褐色，镜检菌丝粗壮，染色深，网状，即可进入种子罐 培养。2. 根据权利要求1所述的吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，其特征在于，步骤a)中 平板培养所用培养基的配方为：可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母浸膏0.1-0.8wt%，硫酸镁 0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氢钾 0 · 025-0 · 075wt%，琼脂粉 1 · 5-2 · 5wt%，余量为水。3. 根据权利要求1所述的吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，其特征在于，步骤b)和 步骤d)中斜面培养所用培养基的配方为:可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母浸膏0.1-0.8wt%，硫 酸镁 0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氢钾0 · 025-0 · 075wt%，琼脂粉 1 · 5-2 · 5wt%，余量为水。4. 根据权利要求1所述的吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，其特征在于，步骤e)所 述种子摇瓶培养基的配方为：淀粉1.5-2.5wt%，黄豆饼粉1.0-2.Owt%，氯化钠0.2-1.Owt%， 葡萄糖0.5-2.5wt%，蛋白胨0.25-1 .Owt%，酵母粉0.1-0.6wt%，硫酸铵0.1-1 .Owt%，硫酸镁 0 · 01-0 · 05wt%，磷酸二氢钾 0 · 01-0 · 05wt%，余量为水。
【专利摘要】本发明公开了一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，该方法主要步骤为将原始菌种平板划线制备单菌落，将单菌落传接斜面上，培养适当时间，然后用接种环将斜面孢子刮下用冷冻真空干燥法制备冻干菌种管；取此冻干菌种管，制成孢子悬液，涂布斜面上，培养适当时间，然后用接种环将斜面孢子刮下，制成孢子牛奶悬液进行分装后冷冻保藏制备孢子牛奶冷冻管。取孢子牛奶冷冻管融化后接入种子培养基中，摇瓶震荡培养适当时间，然后接入种子罐。该方法克服了生产斜面菌种接种生产同步性差，种子瓶生长周期长短不一，批次更换频繁等缺点。本发明的制备方法操作简便，提高了菌种的种龄和种子质量的一致性，减少种子更换批次，非常适合吉他霉素工业化生产。
【IPC分类】C12N1/04, C12R1/465, C12N1/20
【公开号】CN105420148
【申请号】CN201510886364
【发明人】刘守强, 吕和平, 刘丽杰, 刘果, 陈忠刚, 陈金春, 王留国, 王雪洁, 谢书勤, 张钦林, 李爱玲, 张红辉, 王海霞, 庞云静, 马珍珍
【申请人】天方药业有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月7日