率超过 80 %，二酰化产物低于6 %。本发明在ρΗ7.0碱性条件下终止反应，便于下一步阴离子纯化的 上样。本发明的酰化反应时间较短，副产物少，整体收率增加，生产成本明显降低，对于规模 化、工业化制备地特胰岛素或其类似物，提供了一种简捷、高效的方法。
[0022] 本发明所涉及到的术语定义
[0023]除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0024]地特胰岛素:是原型胰岛素去除了Β链第30位苏氨酸，通过酰化作用在Β29位赖氨 酸侧链ε_氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，是一种胰岛素类似物。
[0025] 蛋白质的"酰化"是指在蛋白质的一个或多个游离氨基上共价引入酰基的过程。氨 基的酰化是常见的蛋白质化学修饰方式之一。
[0026] 选择性酰化:是原型胰岛素去除了Β链第30位苏氨酸在进行酰化反应时，在游离α 氨基存在的情况下，不需要酰化前将α氨基保护，酰化后再去保护的操作。
【附图说明】
[0027]图1为重组人胰岛素前体蛋白酶切后获得desB 30蛋白；
[0028]图2为活化酯与desB30的摩尔比对酰化效果的影响；
[0029]图3为HPLC检测本发明一步酰化制备地特胰岛素的酰化效率结果；
[0030]图4为本发明方法所制备地特胰岛素与地特胰岛素标准品的HPLC测定结果。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0032]实施例1重组人双链胰岛素前体(desB30)的制备
[0033]重组人双链胰岛素前体(desB30)的制备参考有关文献(刘海峰，重组胰岛素前体 转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究，华东理工大学，博士学位论文.2013)。具体如 下：
[0034] 1.1试验材料及仪器
[0035] 氯化钠 (NaCl)、盐酸(HC1)和氢氧化钠 (NaOH)购自国药集团化学试剂有限公司；乙 腈(CH3CN，HPLC级）、三氟乙酸（TFA，HPLC级）购自J&K Chemi ca 1公司；分析型高效液相仪器 为安捷伦1260，分析型色谱柱为Kromasil-C18-5ym_l 〇〇 A (4.6mmX 250mm);层析纯化系统 为瑞典Pharmacia Biotech公司AKTA explorer 100层析工作站，所用层析柱为)(K 5.0cmX 20·0cm(装填体积为300ml)，所用阳离子填料为CMSepharoseFF，购自GE。
[0036] 1 · 2样品纯度检测方法
[0037] 采用反相层析方法对粗样和纯化收集的样品进行检测，仪器为安捷伦1260分析型 高效液相，分析色谱柱：Kromasil-C18-5ym-l 〇〇 A (4 · 6mmX 250mm)。流动相A相为0 · 1 % TFA;流动相B相:0.1 % TFA与80 %乙腈混合液。流速为1.0ml/min，柱温为30°C，检测波长为 280nm<a5-50%B相梯度洗脱25min。保留时间在10-llmin的主峰即为重组人胰岛素前体蛋 白，保留时间在ll_12min的主峰为desB 30蛋白。纯度计算采用面积归一法。
[0038] 1.3含有重组人胰岛素前体的发酵上清的制备
[0039] 人工合成ILP基因和质粒pPIC9K分别用Xho I和EcoRI进行酶切，回收相应的目的 片段和质粒大片段，将两个片段用T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pPIC9K: : ILP，然后将构 建好的重组质粒PPIC9K: : ILP大量制备，线性化，电穿孔转化宿主细胞P. pastorisGSl 15，涂 布MGY(His-)平板，挑选高拷贝的阳性克隆，其中，构建的胰岛素前体蛋白（ILP)的氨基酸序 列（SEQ ID N0.1)为：
[0040] eeaeaeaepk (间隔肽）;1^叫111〇88111￥6&171￥〇86坪€€5^口1<:(缺少30位苏氨酸的13链） aak(，J、Cjft)giveqcctsicslyqlenycn(Afj|)〇
[0041] 培养所述工程酵母菌株，分泌表达出人胰岛素前体蛋白；将发酵液通过离心获得 含有目的蛋白的上清液。
[0042] 1.4重组人胰岛素前体的纯化和酶切制备desB 30蛋白
[0043] 将发酵上清用0.45μπι的微孔滤膜过滤后，用去离子水稀释10倍，调pH 3.5，稀释后 的上清液连续上样，上样量不超过介质最大结合量的70%，层析流速为40ml/min。
[0044] 层析所用平衡液为50111111〇1/1柠檬酸钠，？!13.5;洗涤液为平衡液+0.1111 〇1/1似(：1， 口113.5;洗脱液为平衡液+0.5111〇1/1似(：1，？!13.5;上样完毕，用平衡液平衡至基线稳定，用 洗涤液洗涤杂蛋白，用洗脱液洗脱收集目的蛋白。
[0045]将经CM Sepharose FF离子交换层析得到的CM收集液进行C18反相层析:层析柱为 瑞典AkzoNobel公司的Kromasil半制备型色谱柱，规格为250_X 21 · 2_，填料为C18_10ym-100 人。层析方法:A相为0 · 1 % TFA ddH2〇; B相为 100 % CH3CN;流速为20ml/min; 20 % B相平 衡反相柱至基线稳定;CM收集液经0.45μπι的微孔滤膜过滤后上样，20 相再平衡，线性梯 度洗脱程序为〇_20min，20-40 % (B)，收集洗脱峰。收集液旋蒸去除有机相后，冻干得膜岛素 前体蛋白粉末。
[0046]用50mmo 1 /L，pH 8.0的Tri s缓冲液把胰岛素前体蛋白粉末配制成2.0mg/ml的溶 液。按胰蛋白酶与胰岛素前体为1: 200 (w/w)的比例，加入胰蛋白酶，混匀。室温(25°C)酶切 4h，得到目的产物desB 30(图1)。
[0047]实施例2地特胰岛素的制备
[0048] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末分别溶于120mmol/L pH 2的磷酸氢二 钠和120mmol/L pH 2的硼酸溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得 desB30终浓度均为6mg/ml。将活化酯（肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于纯乙腈中，超声至 完全溶解，使得活化酯浓度为l〇mg/ml。
[0049]用lmol/L NaOH将desB30前体溶液均调pH至9.5，均加入纯乙腈，使得乙腈所占体 积是总反应液体积的50%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯 与desB30的摩尔比约为1:2,搅拌反应60min，反应的温度为25°C。
[0050] 加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测。根据公式： 酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X 100%，计算出，采用磷酸氢二钠的条件 下的酰化反应产率为70%，采用硼酸的条件下的酰化反应率为55%。
[0051] 可以看出，desB30溶液在不同的缓冲液下溶解，磷酸氢二钠的效果比硼酸好，因为 硼酸溶液存在下会产生一个较大脱氨杂峰，影响酰化率。
[0052]实施例3地特胰岛素类似物的制备
[0053] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于1