15min的酰化反应产 率为74%、反应20min的酰化反应产率为79%、反应25min的酰化反应产率为86.8%、反应 45min的酰化反应产率为86%、反应60min的酰化反应产率为85.7%。
[0079] 本发明发现反应25min即可达到86.8%的酰化率（图3)，时间加长，对酰化率的影 响不大。由此可见，酰化25min达到工艺最优。本发明方法所制备的地特胰岛素与地特胰岛 素标准品的HPLC测定结果见图4。
[0080] 本发明实施例4、实施例7和实施例8的具体酰化产率见表1。
[0081] 表1酰化条件与酰化产率
[0082]
[0000J
[0084]实施例9地特胰岛素的制备
[0085] 将重组人双链胰岛素前体(desB30)冻干粉末溶于100mm〇l/L pH 3的磷酸氢二钠 溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活 化酯（肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为l〇mg/ ml 〇
[0086] 用lmol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反 应液体积的40%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30 的摩尔比约为1:1，搅拌反应25min，反应的温度为25°C。
[0087] 加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，存放4°C冰箱内。存放0天， 1天，3天，5天。采用液相检测，根据公式:酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X 100%，存放0天的酰化产率为86.3%，存放1天的酰化产率为85.8%，存放2天的酰化产率为 85.13%，存放3天的酰化产率为83.27%，存放4天的酰化产率为80%，存放5天的酰化产率 降低较为明显为75%。
[0088] 结果表明，pH 7.0的终止条件下存放3天，酰化产率变化不大（少量在碱性条件下 转换成脱氨胰岛素），且酰化制备的地特胰岛素可以直接完成后期的阴离子纯化分离工作。 [0089]实施例10地特胰岛素的制备
[0090] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶 液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度为4mg/ml。将活化酯 (肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于纯乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为8mg/ml。
[0091] 用lmol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得乙醇所占体积是 总反应液体积的40%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与 desB30的摩尔比约为1:1，搅拌反应25min，反应的温度为15°C。
[0092] 加入lmol/L HC1调节反应液的pH至6.5,终止酰化反应，采用液相检测，根据公式： 酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X 100%，计算出酰化反应率为78%。
[0093]实施例11地特胰岛素的制备
[0094] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于50mmol/L pH 4的磷酸氢二钠溶液 中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度为8mg/ml。将活化酯 (肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于纯乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为12mg/ ml 〇
[0095] 用lmol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得乙醇所占体积是 总反应液体积的30%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与 desB30的摩尔比约为1:1，搅拌反应25min，反应的温度为30°C。
[0096] 加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.5,终止酰化反应，采用液相检测，根据公式： 酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X 100%，计算出酰化反应率为78.7%。
【主权项】
1. 地特胰岛素或其类似物的制备方法，包括以下步骤：（1)将人双链胰岛素前体desB30 溶解于水相缓冲液中得到desB30前体溶液，调节desB30前体溶液的pH值后加入有机相，混 匀得到混合溶液；（2)向混合溶液中加入活化酯溶液进行选择性酰化反应；（3)终止反应，分 离纯化，即得;其特征在于:步骤(1)中调节desB30前体溶液的pH值至8.0-11.0。2. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)调节desB30前体溶液的pH值 至9.0-9.5,优选为9.0。3. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述选择性酰化反应中，活化 酯与人双链胰岛素前体desB30的摩尔比为4:1-1:4,优选为2:1-1:2，更优选为1:1。4. 按照权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述选择性酰化反应的时 间为15-60min，优选为25-60min，更优选为25-45min。5. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤（1)所述水相缓冲液为磷酸氢二 钠缓冲液;优选的，所述磷酸氢二钠缓冲液的浓度为50-120mmol/L，pH值为2-4;更优选的， 所述磷酸氢二钠缓冲液的浓度为100mm〇l/L，pH值为3。6. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述活化酯溶液是将活化酯 溶解于有机相中，使活化酯的浓度为8_12mg/ml，优选为10mg/ml;其中，所述有机相选自乙 腈、甲醇或乙醇中的任意一种，优选为乙醇； 步骤(2)所述选择性酰化反应是利用活化酯酰化人双链胰岛素前体desB30的B29位赖 氨酸的ε_氨基。7. 按照权利要求3或6所述的制备方法，其特征在于:所述活化酯选自肉豆蔻酸丁二酰 亚胺酯、棕榈酸Ν-琥珀酰亚胺基酯、辛酸Ν-琥珀酰亚胺基酯中的任意一种。8. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤（1)所述desB30前体溶液中，人双 链胰岛素前体desB30的终浓度为4-8mg/ml，优选为6mg/ml。9. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤（1)所述有机相的体积是混合溶 液总体积的30-50%，优选为40%;其中，所述有机相选自乙腈、甲醇或乙醇中的任意一种， 优选为乙醇。10. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述选择性酰化反应的温度 为15-30°C，优选为25°C;步骤（3)所述终止反应为调节反应液的pH值至6.5-7.5，优选为 7.0〇
【专利摘要】本发明公开了一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，属于胰岛素类似物的制备领域。本发明以B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30蛋白为原料，在未保护desB30蛋白双链N末端α-氨基的条件下，在pH？8.0-11的碱性环境下利用活化酯一步选择性地酰化B29位赖氨酸的ε-氨基，高效生成地特胰岛素或其类似物。本发明对胰岛素前体的酰化反应的pH值、原料比以及酰化时间等参数进行了优化，显著提升了地特胰岛素或其类似物的收率，具有酰化效率高、副产物少、酰化反应时间短、酰化步骤少、工艺简单、生产成本低等优点，为规模化、工业化一步酰化制备地特胰岛素或其类似物提供了一种简捷、高效的方法。
【IPC分类】C07K14/62
【公开号】CN105440125
【申请号】CN201510835561
【发明人】刘海峰, 周祥山, 黄菁, 李志 , 方喆, 应欢, 聂洪霞, 史兆松
【申请人】山东阿华生物药业有限公司, 东阿阿胶股份有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月25日