384有70%的序列相似性。
[0070] pAcCRl是一个新的冰草染色体着丝粒序列。
[0071] 二、pAcCRl在冰草染色体上的分布特征与特异性验证
[0072] 以pAcCRl为探针，分别对小麦-冰草6P二体附加系4844-12、冰草Z1842和冰草 Z589进行FISH(荧光原位杂交）分析。
[0073] 小麦-冰草6P二体附加系4844-12的FISH结果见图1。结果表明，pAcCRl只在 6P染色体的着丝粒处有分布，而在小麦源的42条染色体上均无信号。
[0074] 冰草Z1842的FISH结果见图2。pAcCRl在14条染色体的着丝粒处均有分布，染 色体着丝粒以外的区域均无信号。
[0075] 冰草Z589的FISH结果见图3, pAcCRl在28条染色体的着丝粒处均有分布，染色 体着丝粒以外的区域均无信号。
[0076] 结果表明，pAcCRl是冰草P基因组染色体着丝粒区特异的。
[0077] 实施例2、特异引物对的开发
[0078] 1、基于pAcCRl设计了特异引物对如下：
[0079] AcCRIF(上游引物，序列表的序列 2) :5' -GGCAAGGGAGTAACACAAGC-3' ；
[0080] AcCRIR(下游引物，序列表的序列 3) :5' -CCCCTCCAATTGTGAAAAGA-3'。
[0081] 2、分别提取各个待测样本的基因组DNA。
[0082] 3、分别以各个基因组DNA为模板，采用步骤1得到的特异引物对进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物。
[0083] 4、将步骤3得到的各个PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。
[0084] 图4中，Μ对应marker，1对应冰草Z559, 2对应小麦Fukuho, 3对应小麦-冰草6P 二体附加系4844-12,4对应小麦-冰草附加系5113, 5对应小麦-冰草附加系5114,6对 应小麦-冰草附加系Π -26,7对应小麦-冰草附加系II-29-2i，8对应小麦-冰草附加系 5106,9对应小麦-冰草附加系11-5-1，10对应小麦-冰草附加系11-4-2,11对应小麦-冰 草附加系5038,12对应小麦-冰草附加系5043,13对应小麦-冰草附加系11-21-2,14对 应小麦-冰草附加系Π -21-6,15对应小麦-冰草附加系11-9-3,16对应小麦-冰草附加 系11-30-5,17对应小麦-冰草附加系11-1-3,18对应小麦-冰草附加系11-3-1，19对应 小麦-冰草附加系Π -7-1，20对应小麦-冰草附加系11-8-1，21对应小麦-冰草6P长臂 端体系，22对应小麦-冰草6P短臂端体系。
[0085] 结果表明：米用所述特异引物对，在冰草Z559、各个小麦-冰草附加系、小麦-冰 草6P长臂端体系、小麦-冰草6P短臂端体系上均可以扩增得到特异条带，而在小麦Fukuho 上不能扩增得到特异条带，说明所述特异引物对的靶序列为P基因组特异的分子标记。 [0086] 回收各个特异条带并进行测序，测序结果表明，各个特异条带的大小均为 767bp±5bp〇
[0087] 实施例3、特异引物对的特异性
[0088] 1、分别提取各个待测样本的基因组DNA。
[0089] 2、分别以各个基因组DNA为模板，采用AcCRIF和AcCRIR组成的特异引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0090] 3、将步骤2得到的各个PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。
[0091] 图5中，Μ对应marker，1对应冰草Z1842, 2对应冰草Z559, 3对应冰草Z1750,4对 应小麦中国春，5对应小麦Fukuho, 6对应栽培一粒小麦M04, 7对应硬粒小麦京DR3,8对应 提莫菲维小麦Tip 9对应尾状山羊草Ael4,10对应粗山羊草Y93,11对应顶芒山羊草Y258， 12对应拟斯卑尔脱山羊草Ae49,13对应小伞山羊草Y39,14对应黑麦RM2161，15对应栽培 大麦浙皮1号，16对应长穗偃麦草PI547326,17对应簇毛麦Z1731，18对应新麦草R429,19 对应假鹅观草Z1365, 20对应鹅观草Z2192。
[0092] 结果表明，AcCRIF和AcCRIR组成的特异引物对对小麦族中的A、B、D、S、C、G、M、 U、R、Η、E、V、St、Ns、Y等基因组无扩增，特异性强。
[0093] 实施例4、特异引物对与对照引物对的性能比较
[0094] 1、分别提取各个待测样本的基因组DNA。
[0095] 2、分别以各个基因组DNA为模板，采用AcPRIF和AcPRIR组成的特异引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0096] 3、将步骤2得到的各个PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果见图6。
[0097] 图6中，Μ对应marker，1对应冰草Z559, 2对应小麦-冰草6P二体附加系4844-12， 小麦-冰草附加系5113,4对应小麦-冰草附加系11-9-3, 5对应小麦-冰草附加系11-5-1， 6对应小麦-冰草附加系5043, 7对应小麦Fukuho, 8对应提莫菲维小麦1^,9对应尾状山 羊草Ael4,10对应黑麦RM2161，11对应拟斯卑尔脱山羊草Ae49,12对应簇毛麦Z1731。
[0098] 结果表明，AcCRIF和AcCRIR组成的特异引物对在冰草、各个小麦-冰草附加系上 均可以扩增得到特异条带，而在小麦族各个品种上不能扩增得到特异条带，即其靶序列为 冰草基因组特异。
[0099] 4、分别以各个基因组DNA为模板，采用ControlF和ControlR组成的对照引物对 进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0100] ControlF(上游引物）：5, -ATTTTACCGTCCTTGCTTAC-3,；
[0101] ControlR(下游引物）：5' -TTCAAAAATCCCCACCAAAA-3'。
[0102] 5、将步骤4得到的各个PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果见图7。
[0103] 图7中，Μ对应marker，1对应冰草Z559，2对应小麦-冰草6P二体附加系4844-12， 小麦 -冰草附加系5113,4对应小麦-冰草附加系11-9-3, 5对应小麦-冰草附加系11-5-1， 6对应小麦-冰草附加系5043, 7对应小麦Fukuho, 8对应提莫菲维小麦1^,9对应尾状山 羊草Ael4,10对应黑麦RM2161，11对应拟斯卑尔脱山羊草Ae49,12对应簇毛麦Z1731。
[0104] 结果表明，ControlF和ControlR组成的对照引物对在冰草、各个小麦-冰草附加 系、小麦族各个品种上均可以扩增得到条带，特异性很差。
【主权项】
1. 一种特异引物对，由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的 单链DNA分子组成。2. 权利要求1所述特异引物对在鉴定待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝 粒区的遗传物质中的应用。3. -种检测待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质的方法，包 括如下步骤：以待测植物材料的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行 PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测植物材料含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物 质，如果没有得到PCR扩增产物、待测植物材料可能不含有来源于冰草染色体着丝粒区的 遗传物质。4. 一种DNA分子，为如下（a)或（b): (a) 序列表的序列1自5'末端第37-803位核苷酸所不的DNA分子； (b) 序列表的序列1所不的DNA分子。5. 权利要求4所述DNA分子在鉴定待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区 的遗传物质中的应用。6. -种检测待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质的方法，包 括如下步骤：采用权利要求4所述DNA分子作为探针，对待测植物染色体进行荧光原位杂 交，如果具有荧光信号、待测植物材料含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质，如果不 具有荧光信号、待测植物材料可能不含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质。7. 序列表的序列1所示的DNA分子作为逆转座子的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子序列及其应用。本发明提供的冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子，为如下(a)或(b)：(a)序列1自5’末端第37-803位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列1所示的DNA分子。本发明还保护由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成的特异引物对。本发明的意义如下：(1)着丝粒逆转座子pAcCR1的获得对于研究冰草属植物的演化具有重要作用；(2)由于大量小麦-冰草易位系的获得，使得对外源冰草染色质的快速检测提出了新的挑战，而基于P基因组着丝粒区的逆转座子特异分子标记的获得可以对小麦背景下的冰草着丝粒区的P染色质进行高效检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105441428
【申请号】CN201410386636
【发明人】李立会, 刘伟华, 韩海明, 宋利强, 胡赞民, 张锦鹏, 鲁玉清, 高爱农
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月7日