(3)扩增体系：
[0055] ITS序列PCR扩增体系如表1所示:表1.
[0056]
[0057] 注:表1中的Template DNA为上述制成DNA模板。
[0058] PCR反应条件如表2所示：
[0059] 表2.
[0060]
[0061]
[0062] 注:表2中步骤2进行30个循环。
[0063] PCR扩增产物的电泳检测：
[0064]电泳条件为1%的琼脂糖凝胶(含Goldview 5μl/100ml)，lXTBE电泳缓冲液，90V 电压电泳1小时，PCR产物上样量为3yL，与lyL Loading dye混匀后点样。
[0065] 在254nm紫外下观察结果，以TaKaRa公司的DL1000DNA Marker为核酸标准分子量 参照物，确定扩增片段长度。扩增产物带应在标准物400-700bp的位置上。
[0066] PCR产物纯化和测序：由深圳华大基因科技有限公司进行。
[0067]系统进化树的构建：
[0068] 将所测的ITS序列与GenBank基因库中已测定的真菌的ITS序列进行比对，根据比 对结果下载相关序列。通过MEGA 6.0的邻接算法(Neighbor-joining NJ)进行系统分析并 构建系统进化树，如图3所示。
[0069]结果：
[0070](一）菌株形态特征
[0071 ]菌落形态特征:PDA培养基上，菌落圆形，基内菌丝灰白色，辐射状，气生菌丝白色， 棉絮状，如图2中al所示。
[0072] 孢子形态特征：大部分弯月形，偶见条形；大型分生孢子：（5.00~6.25 )μπιΧ (23.75~40.00)以111;小型分生孢子：（3.75~5.00)4111\(8.75~13.75)4111，如图2中131所示。 [0073](二)菌株ITS序列及其系统发育学分析
[0074] 利用引物ITS1和ITS4,从菌株基因组DNA中扩增出一条500-600bp大小的片段，经 测序并将测序结果通过GenBank中BLASTn比对。结果表明，菌株TRXY-34-1与Fusarium属中 的真菌有很高的碱基序列相似性，因此下载GenBank中Fusarium属的参考菌株序列，用于系 统发育分析，以 Thelonectria 属中的 Thelonectria westlandica(KF569844)和 Thelonectria trachosa(KF569842)作为外群。在构建的系统进化树中，TRXY-34-1与 Fusarium solani及Fusarium oxysporum的多个株系聚在一起形成支持强度为99%的末端 分支。喊基相似性比较结果表明，TRXY-34-1与Fusarium solani及Fusarium oxysporum喊 基序列没有差异，序列相似性为100%。综合形态学和分子生物学特征，将菌株初步鉴定为 Fusarium solani。
[0075] 实施例2
[0076] 菌株的代谢产物对三七根腐病菌的抑制作用
[0077] -、菌的发酵培养和发酵产物的提取
[0078] (1)将越南槐内生真菌TRXY-34-1接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平面皿(PDA平 板）中，置于温度为28°C下培养20天，所得培养材料切成块状并转移到无菌固体培养基(含 400g马铃薯、20g的右旋糖和20g蔗糖）的2升的锥形瓶中，置于28°C条件下发酵60天；
[0079] (2)发酵完成后，用发酵物2倍的甲醇浸泡发酵物并超声40min，然后用纱布过滤， 取滤液；
[0080] (3)重复步骤（2)两次，合并两次滤液进行减压浓缩成浸膏，得到内生真菌TRXY- 34-1发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生真菌TRXY-34-1代谢产物。
[0081 ]二、越南槐内生真菌TRXY-34-1代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生长的抑制作用 [0082]用菌丝生长法测定菌株TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制活 性。将菌株TRXY-34-1的代谢产物和多菌灵粉剂（阳性对照）分别制成含2mg/mL，4mg/mL， 8mg/mL浓度代谢产物的含药平板。在无菌条件下，用打孔器将三七根腐病菌制成6mm菌饼， 把三七根腐病菌菌饼接到各含药平板中央为处理，以不含药平板中央接的三七根腐病菌菌 饼为阴性对照，所有处理和对照重复三次，所有平板置于28°C培养。药物浓度按多菌灵粉剂 的田间应用浓度设置。待阴性对照长满培养皿时，分别测量对照菌落和处理菌落的生长直 径，并根据以下公式，计算抑制率：
[0083] 阴性对照生长量=阴性对照生长直径-菌饼直径
[0084] 朴理牛长量=朴理牛长官径-菌饼官径
[0085]
[0086]三、越南槐内生真菌TRXY-34-1代谢产物对三七根腐病菌的最小抑菌浓度 [0087]用肉汤稀释法测定菌株TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌的最小抑菌浓度。 将在PDA培养基中培养5天的三七根腐病菌菌饼接种于含0.2%吐温80(v/v)的液体培养 基中，28°C，150r/min摇床培养7天，然后将培养物转到三角瓶，并倒入含0.2 %吐温80的无 菌双蒸水，用磁性棒搅拌30min，将溶液用无菌纱布过滤，得到孢子溶液，并用血球计数板将 孢子浓度调节到每毫升1〇 4个孢子备用。将菌株的代谢产物用1%DMS0溶解成80mg/mL的代 谢产物处理浓度，取5支无菌试管依次排列在试管架上，分别编号为1、2、3、4、5，每管分别加 入lml含0.2%吐温80的无菌双蒸水，然后将lml 80mg/mL的菌株甲醇粗提物溶液加入编号 为1的试管中并依次在各管中进行两倍连续稀释，并将lml上述所得孢子溶液（10 4个/ml)分 别加入各管中，从而获得最终的TRXY-34-1代谢产物的处理浓度：20mg/ml(编号1试管）， 10mg/ml (编号2试管），5mg/ml (编号3试管），2 · 5mg/ml (编号4试管），1 · 25mg/ml (编号5试 管hlml的1%DMS0和lml的8mg/mL氟硅唑乳油分别代替代谢产物执行上述处理过程而作为 阴性对照和阳性对照，所有处理和对照重复三次。最后，各管2 8 °C，15 0 r /m i η摇床培养5天。 TRXY-34-1的代谢产物的MIC值为完全抑制三七根腐病菌可见生长的最小粗提物浓度。 [0088]结果：
[0089]菌株越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的百分抑 制率如表3中所示：
[0090] 表3.
[0091]
[0092]注:表中阳性对照多菌灵粉剂含50%多菌灵;表中*表示数据通过单因素方差分析 的LSD比较后，菌株TRXY-34-1的代谢产物和阳性对照多菌灵粉剂在相同浓度下，在PQ.〇5水 平上具显著性差异。
[0093]菌株越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制结果 表明，菌株越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生长均具有非常 好的抑制效果，从表3可以看出TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌F.solani菌丝生长的 百分抑制率为68.10-94.90%。与阳性对照多菌灵粉剂比较，菌株TRXY-34-1的甲醇粗提物， 对三七根腐病菌F.solani菌丝生长的抑制效果略低于对照。
[0094]越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌生长的最小抑菌浓度如表 4所示：
[0095] 表4.
[0096]
[0097 ] 注:表中阳性对照氟娃唑乳油有效成分含量为40 Omg/mL。
[0098]菌株越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌生长的最小抑菌浓度 测试结果表明，菌株越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌均具有较强的 抑制作用，从表4可以看出越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物对三七根腐病菌F. solani 的最小抑菌浓度为l〇mg/ml。
[0099]从表3和表4可知，菌株越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物中含有很强的抑真 菌或杀真菌的成分，因此，在三七根腐病菌的生态防治上，菌株越南槐内生真菌TRXY-34-1 具有突出的潜力。
[0100]前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
[0101]
【主权项】
1. 一种越南槐内生真菌TRXY-34-1，其特征在于:越南槐内生真菌TRXY-34-1的分类命 名为腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)TRXY-34-l，保藏号:CGMCCNo.10767。2. -种如权利要求1所述的越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物的制备方法，其特征 在于，操作步骤如下： (1) 将越南槐内生真菌TRXY-34-1接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平面皿中，置于温度 为28°C下培养20天，所得培养材料切成块状并转移到无菌固体培养基中，置于28°C发酵60 天； (2) 发酵完成后，用发酵物2倍的甲醇浸泡发酵物并超声40min，然后过滤； (3) 重复步骤(2)两次，合并两次滤液进行减压浓缩成浸膏，得到内生真菌TRXY-34-1发 酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生真菌TRXY-34-1代谢产物。3. 根据权利要求2所述代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤（1)中所述的无菌固体 培养基含400g马铃薯，20g的右旋糖和20g蔗糖。4. 一种如权利要求2制备所得越南槐内生真菌TRXY-34-1的代谢产物在防治三七根腐 病中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种越南槐内生真菌TRXY-34-1，越南槐内生真菌TRXY-34-1的分类命名为腐皮镰孢菌（Fusarium？solani）TRXY-34-1，菌株的ITS序列如SEQ？ID？NO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年05月13日，保藏号：CGMCC？No.10767。本发明首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株内生真菌(Fusarium？solani)TRXY-34-1，该菌对三七根腐病菌具有很强的抑制作用，为三七真菌病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。CGMCC No. 1076720150513
【IPC分类】A01N63/04, A01P3/00, C12P1/02, C12N1/14, C12R1/77
【公开号】CN105483020
【申请号】CN201510979147
【发明人】黄荣韶, 姚裕群, 蓝芳, 李良波
【申请人】广西大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日