启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及启动子化R12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白襲芦醇的方法， 属于植物基因工程领域。 技术背景
[0002] 白襲芦醇(Resveratrol，简称Res),是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、 花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性，是一种天然的 抗氧化剂，可W降低血脂，抑制血小板凝结，抗癌，抗炎，抗福射，抗衰老，防治屯、血管疾病 等。它与紫杉醇都被誉为绿色抗癌药物。但自然界中存在的白襲芦醇的含量较少，利用植物 基因工程技术高效生产白襲芦醇是大量获得白襲芦醇的重要途径。
[0003] 白襲芦醇广泛存在于种子植物中，作为巧类次生代谢物，主要通过苯丙氨酸代谢 途径合成的。刘蕾等克隆了白襲芦醇合酶cDNA，并将其转化花生的下胚轴、胡萝h的下胚轴； 同时，也把花生RESS转化酵母。许玉芬等成功构建了花生白襲芦醇合酶基因的酵母表达载 体，并通过电穿孔法将其整合到毕赤酵母的染色体上;成功构建了由化i启动子驱动的花生 白襲芦醇合酶基因单子叶植物表达载体，分别利用农杆菌介导和基因枪转化法转导甘薦。 黄国强等研究了白襲芦醇合酶基因在花生根中的特异表达，研究结果表明：该基因的转录 表达在根的初皮部，其他组织中未见表达;酵母浸提液处理可使该基因的转录表达明显增 强。林荣华等W花生中的白襲芦醇合酶基因为目的基因，构建了含目的基因的植物重组表 达载体地6RS，利用电穿孔法将PB6RS质粒直接导入根癌农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导 将地6RS转化烟草(云烟85)，得到了阳性植株。
[0004] 由于白襲芦醇的重要生理功能，近几年，人们开始研究利用生物技术提高植物材 料中白襲芦醇的含量。Giovinazzo等研究者W35S启动子调控白襲芦醇合酶基因进行番茄 遗传转化，测定转基因番茄中的抗坏血酸盐与谷脫甘肤还原酶的总体水平，结果表明：转基 因植物的抗氧化性较之野生型植物的抗氧化性有了显著的提高。册sken等利用油菜种子特 异表达启动子驱动白襲芦醇合酶基因表达，转化油菜，同时，阻断消耗白襲芦醇合酶底物的 另一条支路，检测To代油菜种巧中的Res含量，发现W鲜重计其最高含量为361 yg/g，同时 还获得了品质改善且保健性提高的油菜种巧。但目前，通过根特异启动子驱动白襲芦醇合 酶基因表达生产白襲芦醇的研究未见报道。
[000引发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性±壤细菌，它能够侵 染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物，诱导植物产生发状根(毛状根）。发状 根相对于正常的根，有很多优点。理论上，发状根来源于一个植物细胞，不是嵌合体，所W其 遗传性状稳定，继代多次仍然具有原始发状根的遗传特性;发状根能够在无外源激素的培 养基中自主生长，且生长速度快，易操作和调控，不受季节和地域限制;某些次生代谢产物 在发状根中含量比正常根高。因此，利用发状根生产次生代谢产物是一条可靠和有效的途 径。
[0006] 本发明针对W上研究背景，利用发根农杆菌介导pBI121-NtR12-AhRESS遗传转化 本生烟草，获得根特异启动子化R12驱动AhRESS表达的转基因本生烟草发状根，通过发状根 液体悬浮培养技术，快速获得大量发状根，进而用于白襲芦醇的生产。该发明为利用烟草根 特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS在本生烟草发状根中特异表达，进而 生产白襲芦醇提供了良好的基础。
【发明内容】
[0007] 本发明利用烟草根特异表达启动子，驱动花生白襲芦醇基因，构建了PBI121-NtR12-AhRESS根特异表达载体，通过冻融法把地I121-NtR12-AhRESS导入发根农杆菌;通过 发根农杆菌介导把化R12:AhRESS融合基因整合到本生烟草基因组，获得根特异启动子 NtRl 2驱动AhRESS表达的转基因本生烟草发状根，建立了发状根液体悬浮培养技术，快速获 得大量发状根，进而用于白襲芦醇的生产。实现了本生烟草发状根生产白襲芦醇。
[0008] 本发明提供了启动子化R12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白襲芦醇的方 法。目的在于提供烟草根特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS在本生烟草 发状根中特异表达，进而生产白襲芦醇的技术，W便利用植物基因工程手段高效生产白襲 芦醇。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 启动子化R12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白襲芦醇的方法，包括W下步骤： (1)克隆烟草根特异启动子化R12和花生AhRESS基因； (2 )烟草根特异启动子NtRl 2驱动花生AhRESS基因表达载体地1121-NtRl 2-AhRESS的构 建； (3) 地I121-NtR12-AhRESS经发根农杆菌介导转化本生烟草； (4) 转地1121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培养； 巧)转地I121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根白襲芦醇含量的检测。
[0010] 所述步骤（1)中所述烟草根特异启动子化R12的序列为SEQ ID No: 1，花生AhRESS 基因的序列为沈Q ID No:2。
[00川所述步骤(2)中所述的根特异启动子驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS表达载体 出发载体为本实验室保存的PBI121质粒载体，所述的启动子是烟草根特异性启动子化R12， 所述的烟草根特异性启动子基因化R2下游包含花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS。
[0012] 所述步骤（3)中发根农杆菌为印度国际半干旱热带作物研究所赠送的发根农杆 菌，其介导的本生烟草遗传转化采用叶盘法。
[0013] 所述步骤(4)中转pBI121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培养所用培养 基为MS培养基巧00 mg/L Cef，第一次继代培养基为MS培养基+300 mg/L Cef，第二次继代 培养基为MS培养基+100 mg/L Cef，第Ξ次继代培养基为MS培养基，Ξ次继代后头抱霉素浓 度降至0。
[0014] 所述步骤巧）中转pBI121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根白襲芦醇含量的检测方 法为HPLC，色谱条件为:色谱柱0DS (250 mmX4.6 mmX5皿），流动相乙腊:水(25:75)，流 速1.0 mL/min，检测波长306 nm，柱溫25°C，进样量10化。
[001引具体方法为： 1.烟草根特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS表达载体PBI121-NtR12-AhRESS 的构建。
[0016] (1)克隆烟草根特异启动子NtR12,并连接至PMD18-T载体中，得到pMD18-NtR12载 体； (2) 地I121-NtR12-GUSA载体构建:将地1121载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因， 从pCAMBIA-1301载体中克隆GUSA基因连接至PBI121载体上，构建PBI121-GUSA;将PBI121-GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR12载体进行酶切反应，将化R12启动 子连接至地1121 -GUSA载体中，得到地1121 -NtRl 2-GUSA载体； (3) pBI121-NtR12-AhRESS载体的构建:克隆花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS基因，并连 接到地1121 -NtRl 2-GUSA载体中，得到地1121 -NtRl 2-AhRESS载体。
[0017] 2.烟草根特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS表达载体地1121-NtRl 2-AhRESS经发根农杆菌介导转化本生烟草。
[0018] 在发根农杆菌诱导植物产生发状根的基础上，利用pBI121-NtR12-AhRESS载体转 化发根农杆菌，通过其介导遗传转化本生烟草，获得转基因本生烟草发状根。WCTAB法提取 转基因本生烟草及对照的发状根的DNA，分别WAhRESS基因特异引物（AhRESS-F:5' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3' 和AhRESS-R:5' TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）和rol B基因 的上、下游弓 I 物（rol B-F : 5 ' GTCCTTGCAGTGCTAGATTT 3'和 rol B-R:5' GAAGGTGCAAGCTACCTCTC3'）进行PCR，PCR反应条件为94°C 5 min一（94°C 30 s一56°C 30 s 一72°C 30 s)35巧cles一72°C 10 min一4°C保存；WCTAB法提取转基因本生烟草及对照的 发状根的RNA，按照PrimeScript逆转录酶说明书逆转录后，WAhRESS基因特异引物 (AhRESS-F:5 ' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和AhRESS-R:5 ' TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）进行RT-PCR，PCR反应条件为：94°C 5 min一（94°C 30 S一57°C 30 S一72°C 1.5 min) 35巧cles一72°C 10 min一4°C保存。筛选阳性发状根进行下一步实验。
[0019] 3.转地I121-NtR12-AhRES