一种提高金藻碳水化合物生产力的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及金藻及细胞内碳水化合物生产。
【背景技术】
[0002] 金藻是一种常见的海洋微藻，营养丰富，是一种主要的巧料藻。金藻细胞内富含多 不饱和脂肪酸及W金藻昆布多糖为主的碳水化合物，其中昆布多糖在肾衰竭防止、痛风等 疾病的防治上具有很好的效果，因此金藻也是一种重要的保健食品原料。
[0003] 近年来，随着第Η代生物能源和新型生物基化学品应用开发的兴起，海洋微藻因 其不占可耕地、不占淡水资源，并可吸收烟道气中的C〇2及利用废水中的氮、磯W解决环境 问题而受到多方面的关注。其中，生物质生产效率的定向调控是微藻应用开发研究的一个 热点。W湛江等鞭金藻自养培养为例，在限氮调控下，细胞干重的60%左右由碳水化合物 构成，同时中性脂比例也升高。但是氮限制也会导致其光合效率下降，碳源输入不足，进而 影响细胞内碳水化合物的生产效率。一个可能的解决方法是在微藻培养过程中引入有机碳 源，W提升碳水化合物的产率和产量。本发明正式在送一思路指导下，将光自养氮限制培养 与辅助碳源添加结合，进一步强化金藻碳水化合物的生产能力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于通过改变培养方式及添加辅助碳源，提高金藻碳水化合物生产 力。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的培养方法包括W下步骤：
[0006] 在金藻氮限制光自养培养过程中，通过添加甘油为辅助碳源，使金藻氮胁迫条件 下储能物质积累与碳源输入相平衡，最终实现碳水化合物产率的提高。
[0007] 1)藻种培养于锥形瓶中，培养至指数生长期使用；
[0008] 2)将指数生长期的藻细胞接种于灭菌的F/2培养基中，添加甘油培养至平台期收 获藻细胞，测定干重；
[0009] 3)碳水化合物的测定；将收获的藻细胞烘干得藻粉，采用硫酸-蔥丽法（参 考文献：[1]冯迪娜，艾江宁，刘亚男，等.含氮类培养基对海洋微藻Isoc虹y sis zhanjiangensis油脂与碳水化合物积累的影响[J].中国生物工程杂志，2011, 10:29-34.) 测定藻细胞内的碳水化合物含量。
[0010] 培养参数：
[0011] 1)氮限制培养指的是W F/2培养基基础上，调整初始氮元素浓度至2. 0~ 3. 0mmol/L( W硝酸钢计），而磯源、金属元素、微量元素各添加常规F/2的2~4倍；
[0012] 2)将指数生长期的藻细胞接种于灭菌的培养基中，添加甘油的时间为接种时添 加，即培养第0天添加；
[001引如添加0. 2~0. 4 % (v/v)的甘油，相对应的浓度为巧~18) X 10 6mmol/L/ cell (每个细胞所受的甘油浓度）；
[0014] 4)培养温度23~27°C，光强110~150umol.m2s 1，光暗比为14h ;10h，通入含 4. 0% C〇2的空气，通气速率0. 4~0. 6vvm。
[0015] 在接种时添加甘油的浓度为巧~18) X 10 6mmol/L/cell。
[0016] 金藻光自养培养过程是指金藻由指数生长期培养至平台期时收获生物质。
[0017] 所述氮限制培养是指接种时使用3x F/2培养基，即氮源、磯源、金属元素、微量元 素各添加常规F/2的3倍。
[001引 F/2营养盐母液配制：
[0019] (1)氮源；称取75g NaN〇3溶于1L去离子水；
[0020] 似磯源：称取5g NaH2P〇4 · &0溶于1L去离子水；
[0021] (3)金属元素：分别称取 3. 15g 化CI3 · 6&0, 4. 36g 胞2邸TA, 0. 0098g CuS04·5H20,0.0063g化2Mo04·2H20,0.022gZnS04·7H20,0.01gCoCl2·細20,0.18g MnClz · 4&0溶于1L去离子水；
[0022] (4)维生素；0.0 Olg vitamin Bi2, 0. 2邑 vitamin Bi, 0.0 Olg D-生物素，溶于 1L 去 离子水。
[0023] 常规F/2培养基的制备：
[0024] 天然海水经过滤灭菌后备用；向海水中添加上述（1)，（2)，（3)，（4)制得的无娃酸 盐的F/2营养盐，其中氮源、磯源、金属元素各Iml/l，维生素0. 5ml/L。
[00巧]有益技术效果
[0026] 1、碳水化合物产量明显高；本发明所得到的藻细胞生物量及其碳水化合物产量有 显著提高达到，碳水化合物最大产率为0. 15g/L/d ;碳水化合物的产量比未添加甘油提高 25%W 上。
[0027] 2、应用前景好；本研究是在光自养培养金藻的过程中添加甘油。甘油是微藻生物 柴油生产的副产物，同时也是一种低值的化工原料，伴随生物柴油加工规模的增长，如何提 升甘油的附加值正逐渐受到人们的关注和重视。本研究利用海水培养微藻，缓解淡水资源 的危机。
【附图说明】
[002引图1为金藻生长曲线图；其中；A为氮限制培养体系金藻藻细胞的生长曲线，B为 氮丰富培养体系金藻藻细胞的生长曲线。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1 ;培养过程生长阶段判定
[0030] 利用0D法，在680nm处测定培养系统中的金藻吸光度，利用"细胞密度 (X104cells/mL) = (ODes〇X125〇-90. 125)X稀释倍数"计算出对应的细胞密度。绘制生长 曲线，W判定细胞生长至稳定期，不同培养条件下，金藻的生长曲线见图1。
[0031] 实施例2 ;营养盐及培养基配制
[0032] 无娃酸盐的F/2营养盐母液配制：
[00对 （1)氮源；称取75g NaN03溶于1L去离子水；
[0034] 似磯源：称取5g NaH2P〇4 · &0溶于1L去离子水；
[0035] (3)金属元素：分别称取 3. 15g 化CI3 · 6&0, 4. 36g 胞2邸ΤΑ, 0. 0098g CuS04·5H20,0.0063g化2Mo04·2H20,0.022gZnS04·7H20,0.01gCoCl2·細20,0.18g MnClz · 4&0溶于IL去离子水；
[0036] (4)维生素；0.0 Olg vitamin Bi2, 0. 2g vitamin Bi, 0.0 Olg D-生物素，溶于 1L 去 离子水。
[0037] F/2培养基的制备：
[0038] 天然海水经莫氧杀菌，两层0. 45 μ m醋酸纤维滤膜过滤，11(TC灭菌15min，冷却后 备用；向海水中添加上述（1)，（2)，（3)，（4)制得的无娃酸盐的F/2营养盐，其中氮源、磯源、 金属元素各Iml/l，维生素0. 5ml/L。
[0039] 实验所用甘油：分析纯甘油与经0. 45 μ m醋酸纤维滤膜过滤的海水W体积比1 ;1 混匀，12rC灭菌20min后冷却，常温保存。
[0040] 实施例3 ;金藻培养
[00川采用实施例2中的F/2培养基，W等鞭金藻化zhangjiangensis)ODes。= 0. 1~ 0. 2、藻液体积约1. 5~2. 0L(在此为2. 0L)接种于化Η角瓶，用日光灯做光源，光强为 30~40 μ mol. m 2s 1，培养3~5天（在此为5天）至指数生长期；离必（3000~4000巧m, 3~5min)(在此为4000巧m，5min)，收获藻细胞，弃上清液，沉淀中添加约3~5血（在此 为5mL)灭菌的海水，使之重新悬浮，加至F/2培养基中，该培养基浓度为3倍实施例2所述 F/2