一种含紫杉醇培养组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物发酵领域，具体设及一种含紫杉醇培养组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇(Paclitaxel)是一种四环二祗类天然抗癌药物，1963年美国化学家瓦尼 (M.C.Wani)和沃尔（Monre E.Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉 (Pacific化W)树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。紫杉醇的制备多采用传统的提取、 分离方法，一般包括a、萃取，W红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物;b、去除胶质，除去 提取物中的胶质杂质；C、分离纯化。
[0003] 微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为 人类所需要的产物的过程。微生物发酵一般较传统的化学提取方法绿色安全，因而近些年 被广泛应用。紫杉醇的微生物发酵培养方法如：中国专利化200810152499.2公开了一种利 用双液相发酵提高真菌产紫杉醇的方法，其包括在培养基中培养产紫杉醇真菌拟盘多毛抱 (Pes1:alotiopsis mic;rospora)NK17,当菌体生长达到平台期，加入有机溶剂继续培养，W 使在所述菌株细胞内和所述培养基中更多地产生和聚集紫杉醇，W及从所述细胞内和培养 基中回收并提纯紫杉醇。该方法紫杉醇产率可达551.72yg/L。如能开发新的紫杉醇产品及 其微生物发酵方法，将有望为紫杉醇或含紫杉醇的产品的制备提供新的途径。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种含紫杉醇培养组合物，该组合物中活性成分紫杉醇的含量和活 性高，具有良好的护肝功效。
[0005] 本发明还提供了一种含紫杉醇培养组合物的制备方法，利用多种真菌发酵南方红 豆杉和蛇六谷，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性，得到具有良好护肝功能的 组合物。
[0006] 本发明发现，通过本发明特定的真菌发酵及特定的工艺，能够有效地将红豆杉中 的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，使各原料资源得到充分的利用，有助于提高 最终产品中活性成分的含量和活性。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[000引一种含紫杉醇培养组合物的制备方法，包括步骤：
[0009] (1)取活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4h-6h，离屯、 收集第一菌体;将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养基中于20°C-30°C解育化-4化，离 屯、收集第二菌体;将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡 摇匀，在20°C-30°C培养2天-10天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；
[0010] (2)取活化后的无花果曲霉菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4h-6h，离屯、收集 第Ξ菌体，将第Ξ菌体悬浮在含化C1的液体MRS培养基中于20°C-28°C解育0.化-3h，离屯、收 集第四菌体;将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀 得到第四菌体液，将第四菌体液接种到含化Cl的液体MRS培养基中于20°c-28°c培养化-30h，得到无花果曲霉菌种子液；
[0011] (3)将步骤(2)的无花果曲霉菌种子液接入红豆杉固态发酵培养基中，在16°C-30 °C培养3天-30天，然后置于交变磁场环境中再培养5天-20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉 碎后得红豆杉固态发酵产物;所述红豆杉固态发酵培养基中含有南方红豆杉和蛇六谷；
[0012] (4)将步骤(3)的红豆杉固态发酵产物经亚临界水萃取，得到红豆杉发酵亚临界萃 取物I，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Π ;
[0013] (5)将步骤(1)的产紫杉醇内生真菌种子液接入内生真菌液体发酵培养基中，调抑 值为3-7，在15°C-25°C培养5天-25天，离屯、，得到内生真菌发酵产物虹；所述内生真菌液体 发酵培养基中含有萃取剩余物Π ;
[0014] 所述含紫杉醇培养组合物为红豆杉发酵亚临界萃取物I和内生真菌发酵产物虹。
[0015] 本发明进行固态发酵时，直接采用经含化C1的液体MRS培养基两步解育处理的无 花果曲霉菌种子液，能够有效地将红豆杉中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化， 同时采用复配的南方红豆杉和蛇六谷，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。步 骤(4)和步骤(5)中，将红豆杉固态发酵产物进行亚临界水萃取，使萃取物中有效成分的活 性得W最大程度保留、含量得W大幅提高;再将萃取后的残渣作为内生真菌液体发酵主要 的培养基，且采用经含胆盐的液体MRS培养基解育处理的产紫杉醇内生真菌种子液，通过一 体化循环利用，使各原料资源得到充分的利用，进一步提高了最终产品中活性成分的含量 和活性。
[0016] 为了达到更好的效果，优选：
[0017] 步骤(1)中，所述含胆盐的液体MRS培养基中胆盐的质量百分含量为0.1 %-0.5%。
[0018] 所述第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1-3， 第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3。
[0019] 步骤(2)中，所述含NaCl的液体MRS培养基中NaCl的质量百分含量为2%-6%。
[0020] 所述第Ξ菌体与用于悬浮第Ξ菌体的含化C1的液体MRS培养基的体积比为1:1-3， 第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3,第四菌体液的接种量为
[0021] 步骤(3)中，所述南方红豆杉可采用南方红豆杉的枝叶;所述蛇六谷可采用蛇六谷 的块茎。
[0022] 所述红豆杉固态发酵培养基每1L中含有5.5g-9. Og南方红豆杉和0.3g-3. Og蛇六 谷。所述红豆杉固态发酵培养基由南方红豆杉、蛇六谷和发酵基础培养基组成，所述发酵基 础培养基采用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配 制。
[0023] 所述红豆杉固态发酵培养基的制备方法，包括:将新鲜南方红豆杉、蛇六谷在自来 水下冲洗干净，惊干，切碎;再将5.5g-9. Og南方红豆杉和0.3g-3. Og蛇六谷用发酵基础培养 基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到红豆杉固态发酵培养基。
[0024] 所述无花果曲霉菌种子液的接入量为红豆杉固态发酵培养基体积的5%-25%。
[0025] 目前产紫杉醇内生真菌发酵技术普遍存在发酵周期长、菌丝生长萌发慢、特征次 生代谢产物含量低等问题。本发明发现将交变磁场处理技术应用于固态发酵中，通过特定 培养时期的适当处理等外界因素有效刺激，提高真菌菌丝在南方红豆杉和蛇六谷培养基料 上的生长代谢，缩短发酵时间，有效促进次生代谢产物的生成。所述交变磁场环境中磁场强 度为0.2mT-6mT，磁场频率为3HZ-40HZ。
[0026] 步骤（4)中，所述亚临界水萃取的条件为：水料质量比为15-50:1，萃取压力在 5MPa-20MPa，萃取溫度为100°C-180°C，萃取时间为10min-60min。
[0027] 步骤(5)中，所述内生真菌液体发酵培养基每1L中含有0.2g-lg萃取剩余物Π 。所 述内生真菌液体发酵培养基由萃取剩余物Π 和发酵基础培养基组成，所述的发酵基础培养 基采用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。
[002引一般发酵基础培养基由W下质量百分比的组分组成：葡萄糖1 %-3 %、 K2HPO40.1 %-0.2%、MgS040. 05%-0.1 % 和余量的水。
[0029] 所述内生真菌液体发酵培养基的制备方法，包括:将0.2g-lg萃取剩余物Π 用发酵 基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到内生真菌液体发酵培养基。
[0030] 所述产紫杉醇内生真菌种子液的接入量为内生真菌液体发酵培养基体积的3%-20%。
[0031 ]所述产紫杉醇内生真菌菌种可采用现有任意一种产紫杉醇内生真菌菌种，可采用 市售产品，例如:美丽镶刀菌(化sarium mairei)菌种，购于北京北纳创联生物技术研究院。
[0032] 所述无花果曲霉菌菌种可采用现有任意一种无花果曲霉菌菌种，可采用市售产 品，例如：无花果曲霉菌(Aspergi 1 lus f icuum)ACCC30360菌种，购于中国农业微生物菌种 保藏管理中屯、。
[0033] 所述液体MRS培养基采用本领域常规的液体MRS培养基，可采用市售产品，也可采 用现有配制方法配制。一般液体MRS培养基的组成为:蛋白腺10.Og、牛肉浸膏10.Og、酵母浸 膏5.Og、葡萄糖20.Og、乙酸钢5. Og、巧樣酸氨二锭2. Og、吐溫-801.0ml、憐酸氨二钟2. Og、硫 酸儀0.2g、硫酸儘0.05g和蒸馈水1.0升。
[0034] 所述PBS缓冲液即憐酸缓冲盐溶液，采用本领域常规的PBS缓冲液，可采用市售产 品，也可采用现有配制方法配制。一般1L PBS缓冲液:憐酸二氨钟0.27g、憐酸氨二钢1.42邑、 氯化钢8g和氯化钟0.2g，加适量去离子水充分揽拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2，最后 定容到1L。
[0035] 所述活化后的产紫杉醇内生真菌菌种、活化后的无花果曲霉菌菌种在液体MRS培 养基中培养的溫度均为自然环境溫度，优选为20°C-30°C。一般1L液体MRS培养基中接入 lcm2-4cm2大小的活化后的产紫杉醇内生真菌菌种菌块、活化后的无花果曲霉菌菌种菌块。 所述产紫杉醇内生真菌菌种或无花果曲霉菌菌种的活化方法采用