一种利用大肠杆菌全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体设及一种W大肠杆菌为生物催化剂合成依折麦布中间体的方法，属于 生物催化领域。
【背景技术】
[0002] 依折麦布是一种胆固醇吸收抑制剂，是目前为止发现的第一个ACAT(乙酷辅酶A-胆固醇酷基转移酶)抑制剂。（4S)-3-[(5S)-5-(4-氣苯基)-5-径基戊酷基]-4-苯基-1,3-氧 氮杂环戊烧-2-酬作为依折麦布的关键手性中间体，它可W由化学/生物不对称还原法或者 酶催化动力学拆分其前体酬制备得到。其中，化学不对称还原法得到的目标产物光学纯度 不够高，同时化学法成本较高，并且化学催化剂容易对环境造成严重的污染。与化学法相 比，生物法表现出明显的立体专一性强、催化效率高和无污染等优点。
[0003] 目前报道的仅有两株菌株对此前体酬具有还原活性，其中，M.J.化mannhas利用微 生物Schizosaccharomyces octosporus ATCC 2479催化还原前体酬生产依折麦布中间体， 转化率约为33% (US Patent 5618707) eUttam C.Banerjee等利用Burkholderia cenocepacia全细胞进行催化还原，产率约为54% (J Ind Microbiol Biotechnol(2009) 36:1369-1374)。除此之外，Codexis从高加索酸奶乳杆菌中一种R型脱氨酶出发进行定向进 化，得到了可W催化合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氣苯基)-5-径基戊酷基]-4-苯基-1,3-氧氮 杂环戊烧-2-酬的S型脱氨酶化S Patent 8415126B2)。
[0004] 本发明将大肠杆菌作为生物催化剂，与底物溶液混合后振荡反应，得到了立体纯 的(4S) -3-[ (5S) -5-( 4-氣苯基)-5-?基戊酷基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烧-2-酬。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明的主要研究内容:本发明利用大肠杆菌全细胞作为生物催化剂，不对称还 原后得到了依折麦布中间体(4S)-3-[(5S)-5-(4-氣苯基)-5-径基戊酷基]-4-苯基-1,3-氧 氮杂环戊烧-2-酬。
[0007] -种利用大肠杆菌全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，，其特征在于包 括W下步骤：
[0008] (1)菌株选择:选用大肠杆菌作为菌种；
[0009] (2)发酵液制备:将大肠杆菌菌种接种至Luria-Bedani液体培养基中，振荡培养， 获得菌株发酵液;将菌株发酵液离屯、后除去上清液得到湿菌体，用pH值为7.0的憐酸盐缓冲 液重悬湿菌体得到湿菌体悬液；
[0010] (3)不对称还原反应:将依折麦布中间体前体酬溶解在二甲基亚讽中，配成底物溶 液;将步骤(2)得到的湿菌体悬液与底物溶液混合制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液。
[0011] 进一步，Luria-Bertani液体培养基配方为:在950ml去离子水中加入蛋白腺lOg、 酵母提取物5g和氯化钢lOg，超声直至溶质溶解.用5mol/LNa0H调抑至7.0，用去离子水定容 至1L，在121°C下，灭菌20min。
[001^ 进一步，步骤(2)中所述的大肠杆菌菌种WO . 1 %~0.5%的体积比接种到Luria-Bertani液体培养基中，37°C，振荡培养12h。
[0013] 进一步，步骤(3)中所述的振荡培养的溫度为37°C，时间为3~24h。
[0014] 进一步，所述的pH值为7.0的憐酸盐缓冲液由0.05丽曰2册〇4:0.05丽a此P化体积比 7:3混合而成。
[001引更具体的：
[0016] 上述的大肠杆菌化scherichia coli)，为常规的，可W购买。
[0017] 培养基为常规Luria-Bedani液体培养基，配方为:在950ml去离子水中加入蛋白 腺lOg、酵母提取物5g和氯化钢lOg，超声直至溶质溶解.用5mol/LNa0H调抑至7.0，用去离子 水定容至1L。在121°C下，灭菌20min。所用试剂是常规可购买的，蛋白腺(0X0ID TRYPT0NE LP0042)，酵母粉提取物(0X0ID YEAST EXTRACT LP0021)，氯化钢(分析纯国药集团化学试 剂有限公司）
[0018] 将发酵液离屯、后除去上清得到湿菌体(湿菌体是指细胞内含有水分的菌体），用抑 值为7.0的憐酸盐缓冲液重悬湿菌体得到湿菌体悬液。
[0019] 步骤(3)中所述的不对称还原反应，将依折麦布中间体前体酬溶解在二甲基亚讽 中，配成底物溶液。将底物溶液加入到湿菌体悬液中，其中每ImL反应体系中包含lOOmg湿菌 体。混合后振荡培养。
[0020] 振荡培养结束，使用乙酸乙醋萃取，产物溶解在有机层中。
[0021] 高效液相色谱条件：
[0022] 化学纯分析条件
[0023] (a)色谱柱:资生堂C18
[0024] (b)柱溫：25°C
[0025] (C)流动相:A相：50mM乙酸锭水溶液（乙酸调节pH至），B相：甲醇，A相与B相流速比 为1:2
[0026] (d)检测器:紫外检测器215nm
[0027] 光学纯分析条件
[002引 （a)色谱柱:0J-H
[0029] (b)柱溫:25°C
[0030] (c)流动相:A相:异丙醇，B相：乙醇，A相与財目流速比为7:3
[0031] (d)检测器:紫外检测器215nm
[0032] 本发明的特点：
[0033] 本发明首次采用大肠杆菌催化前体酬得到依折麦布手性中间体，提供了一种新型 生物催化剂。与化学法相比，本发明具有立体专一性强、环境污染小和条件溫和等优点。
【附图说明】
[0034] 图1是依折麦布中间体前体酬的HPLC图谱
[0035] 图2是标准品消旋体(4S)-3-[5-(4-氣苯基)-5-径基戊酷基]-4-苯基-1,3-氧氮杂 环戊烧-2-酬的手性HPLC图谱。
[0036] 图3是实施例1中大肠杆菌催化还原前体酬后的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本方面做进一步说明，但本发明并不限于W下实施例 [003引实施例1
[0039] 本实施例为一种大肠杆菌全细胞催化合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氣苯基)-5-径基 戊酷基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烧-2-酬。
[0040] 该方法包括如下步骤：
[0041 ] (1)菌株选择:选用大肠杆菌巧scherichia coli BL21)作为菌种，该菌种保藏与- 80。。
[0042] (2)发酵液制备:将所述的大肠杆菌菌种W0.1%的体积比接种至Luria-Bedani 液体培养基中，37°C，220巧m振荡培养24h;
[0043] Luria-Bedani液体培养基配方为:在950ml去离子水中加入膜化蛋白腺lOg、酵母 提取物5g和氯化钢lOg，超声直至溶质溶解.用5mol/L化0H调pH至7.0,用去离子水定容至 1L。在121°C下，灭菌 20min。
[0044] (3)菌体收集:取发酵液在8000巧m转速下离屯、lOmin，除去上清得到湿菌体，收集 湿菌体作为生物催化剂使用；
[0045] (4)不对称还原反应：用抑值为7.0的憐酸盐缓冲液重悬湿菌体得到湿菌体悬液。 所述抑值为7.0的憐酸盐缓冲液由0. 〇5MNa2HP〇4:0.05MNa出P〇4体积比7:3混合而成。将依折 麦布中间体前体酬溶解在二甲基亚讽中，配成底物溶液。
[0046] 将湿菌体悬液与依折麦布中间体前体酬混合，制得菌体混合液，振荡培养，得到反 应液;其1ml反应体系中包含20ul底物溶液(反应体系中底物终浓度为2mM)和lOOmg湿菌体。 所述的振荡培养溫度为37°C，转速为22化pm，时间2地。
[0047] (5)HPLC测定:取1ml上述的反应与1ml乙酸乙醋充分振荡萃取，使目标产物溶解在 乙酸乙醋中，然后在120(K)rpm离屯、Imin，取有机层lOul进行液相检测。液相结果表明，产物 (4S)-3-[(5S)-5-(4-氣苯基)-5-径基戊酷基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烧-2-酬e.e值为 99.99%，底物转化率约为70%
[0048] 实施例1中所采用的试剂和仪器如未特殊说明均为市场常规产品。
[0049] 显然，本发明的上述实施例只是为了清楚地说明本发明所做的举例，并不是对本 发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做 出其他不同形式的变化或变动，例如对大肠杆菌中相应的酶进行克隆表达后催化还原上述 底物。运里无法对所有的实施方式予w穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而 易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 一种利用大肠杆菌全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，，其特征在于包括 以下步骤： (1) 菌株选择:选用大肠杆菌作为菌种； (2) 发酵液制备:将大肠杆菌菌种接种至1^11^3-861^3]1；[液体培养基中，振荡培养，获得 菌株发酵液;将菌株发酵液离心后除去上清液得到湿菌体，用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液重 悬湿菌体得到湿菌体悬液； (3) 不对称还原反应:将依折麦布中间体前体酮溶解在二甲基亚砜中，配成底物溶液； 将步骤(2)得到的湿菌体悬液与底物溶液混合制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液。2. 按照权利要求1的方法，其特征在于，Luria-Bertani液体培养基配方为：在950ml去 离子水中加入蛋白胨l〇g、酵母提取物5g和氯化钠 10g，超声直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调 pH至7.0,用去离子水定容至1L，在121°C下，灭菌20min。3. 按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤（2)中所述的大肠杆菌菌种以0.1 %~ 0.5 %的体积比接种到Lur ia-Ber tan i液体培养基中，37°C，振荡培养12h。4. 按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的振荡培养的温度为37°C，时间 为3~24h。5. 按照权利要求1的方法，其特征在于，所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由 0 · 05MNa2HP〇4:0 · 05MNaH2P〇4 体积比 7:3混合而成。
【专利摘要】一种利用大肠杆菌全细胞催化前体酮合成依折麦布中间体的方法属于生物催化领域。大肠杆菌全细胞催化前体酮合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮具有非常高的立体选择性。其中(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮e.e值为99.99％，转化率约为70％。
【IPC分类】C12R1/19, C12P17/14
【公开号】CN105506022
【申请号】CN201610067795
【发明人】郑国钧, 李欣欣
【申请人】北京化工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月30日