水平上检测SAV1基因的差异表达
[0110] 3.1提取组织总蛋白
[0111] 按照化i如化组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0112] 3.2Weste;rn blot检测
[0113] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗解育、二抗解育、 显色。
[0114] 3.3统计学处理
[0115] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，Wi3-actin为内参，将目的白条 带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.ο统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[0116] 3.4 结果
[0117] 结果如图2所示，与正常肌层组织相比，子宫肌瘤组织中SAV1蛋白含量降低，差异 具有统计学意义(P<〇. 05)。
[011引实施例2 SAV1基因表达质粒构建
[0119] USAV1基因表达载体的构建
[0120] 根据SAV1基因的编码序列（如SEQ ID NO. 1所示）设计扩增引物。从成人胎脑的 cDNA文库klontech公司，货号:638831)中扩增全长的54￥1基因的编码序列，将上述〇0魁序 列插入真核细胞表达载体PCDNA3.1中，连接获得的重组载体PCDNA3.1-SAV1用于后续实验。
[0121] 2、子宫肌瘤细胞的培养与转染
[0122] 手术切除子宫肌瘤后，立即在无菌条件下取每例子宫肌瘤组织1cm，置于lOmL 3% 双抗(青、链霉素）的PBS中，密闭冰浴尽快送入细胞培养室。子宫肌瘤组织用3%双抗的PBS 液漂洗，在含有DMEM培养液的平皿中修剪成1mm;大小的组织块。将剪碎的组织小块用弯头 吸管送入培养瓶中，每小块间距2.0-3.0mm左右。组织块摆好后，将培养液吸出，轻轻将培养 瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入含15 %胎牛血清的DMEM培养液2mL，盖好瓶盖，将培养瓶倒 置放在37°C、5%C02培养箱内。地后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。每2-3d换液1次。待 细胞达80 %融合时，用0.25 %膜蛋白酶消化传代。
[0123] 取第3-4代子宫肌瘤细胞按1 X 10^孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%C02培 养箱中细胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000 (购自于Invi化ogen公司）的说明书转 染，实验分为对照组(转染PCDNA3.1)和实验组(转染PCDNA3.1-SAV1)，转染质粒的工作浓度 是0.5μ邑/ml。
[0124] 3、利用QPCR实验检测质粒转染的效果。
[0125] 3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0126] 3.2逆转录
[0127] 步骤同实施例1。
[012 引 3.3QPCR
[0129] 步骤同实施例1。
[0130] 3.4统计学方法
[0131] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。
[0132] 4、Western 检测
[0133] 具体步骤同实施例1。
[0134] 5、结果
[01巧]如图3所示，与转染PCDNA3.1空载体的细胞相比，转染PCDNA3.1-SAV1的细胞中 SAV1的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05);如图4所示，与转染PCDNA3.1空 载体的细胞相比，转染PCDNA3.1-SAV1的细胞中SAV1的蛋白水平显著上调，差异具有统计学 意义(P<0.05)。
[0136] 实施例3 SAVl基因对子宫肌瘤细胞增殖的影响
[0137] 采用MTT实验检测SAV1基因对子宫肌瘤细胞增殖能力影响。
[0138] 1、步骤:各组细胞转染12h后膜酶消化，制成单细胞悬液，W每孔6000个细胞接种 于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测： 每孔加入5g/L的MTT液20μ1，继续培养地后，吸去培养基，加入DMS0 15化1，细屯、吹打，使紫 蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(Α值）。然后每12h检测1次，连续测 72h，共7次。本实验重复3次。
[0139] 2、统计学方法
[0140] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组 之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0141] 3、结果
[0142] 图5所示的结果显示：转染PCDNA3.1-SAV1组的细胞生长速度明显低于转染 PCDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)上述结果表明SAV1表达 能够抑制子宫肌瘤细胞的生长。
[0143] 实施例4 SAV1基因对子宫肌瘤细胞周期的影响
[0144] 使用流式细胞仪检测细胞周期，在此过程中使用的PI单染试剂购自美国BD公司产 品。
[0145] 1、步骤:各组细胞转染4她后膜酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗涂2次，70 %的乙醇 固定过夜。按操作说明加相应试剂，避光放置30min，流式细胞仪检测各组细胞周期。
[0146] 2、统计学方法
[0147] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。
[0148] 3、结果
[0149] 如表2中显示的结果，与转染PCDNA3.1空载体组细胞相比，转染PCDNA3.1-SAV1组 细胞处于G1期的细胞明显增多，处于S期的细胞明显减少。上述结果表明，SAV1基因表达能 够抑制细胞周期。
[0150] 表2细胞转染后细胞周期变化(百分比） 「01511
[0152] 注:与转染PCDNA3.1空载体组相比，冲<0.05。
[0153] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测SAV1基因表达的产品在制备诊断子宫肌瘤的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、 免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测SAV1基因表达以诊断子宫肌瘤的产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包 括一对特异扩增SAV1基因的引物;所述用实时定量PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包括一对 特异扩增SAV1基因的引物;所述用免疫检测诊断子宫肌瘤的产品包括:与SAV1蛋白特异性 结合的抗体;所述用原位杂交诊断子宫肌瘤的产品包括:与SAV1基因的核酸序列杂交的探 针；所述用芯片诊断子宫肌瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与 SAV1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SAV1基因的核酸序列杂交的探针。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断子宫肌瘤的产品 至少包括的一对特异扩增SAV1基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。5. -种诊断子宫肌瘤的工具，其特征在于，所述工具包括检测SAV1基因表达的试剂;所 述试剂包括检测SAV1基因 mRNA的引物和/或探针、检测SAV1蛋白的抗体。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测SAV1基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。 7. SAV1基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗子宫肌瘤的药物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进SAV1基因表达的试剂、促进SAV1 基因表达产物稳定性的试剂、促进SAV1基因表达产物活性的试剂、促进SAV1基因表达产物 功能的试剂。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进SAV1基因表达的试剂包括含有SAV1基 因的试剂、携带SAV1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有SAV1蛋白质的试剂。10. -种用于治疗子宫肌瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括7-9中任 一项所述的促进剂。
【专利摘要】本发明公开了一种用于子宫肌瘤早期诊断的分子标志物-SAV1基因及其表达产物。本发明利用QPCR和Western？blot方法证明SAV1基因在子宫肌瘤组织和正常组织中存在差异表达，可以作为早期诊断子宫肌瘤的指标。另外，本发明还公开了SAV1基因及其表达产物可以作为子宫肌瘤治疗的靶标，用于指导新药的研发。
【IPC分类】G01N33/574, C12Q1/68, G01N33/68, A61K45/00, A61P35/00
【公开号】CN105506170
【申请号】CN201610113316
【发明人】杨承刚, 边洋, 杜海威
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月29日