液滴储存方法
【专利说明】液滴储存方法
[0001]本发明涉及在基板表面上储存液滴的方法。具体地，其涉及各自含有一个或多个单核苷酸或寡核苷酸的液滴的储存。所述方法可以用于非常大量的微液滴的储存和表征，如可以在来源于天然存在的或合成的DNA或RNA的多核苷酸分析物的测序中生成的。
[0002]遗传物质的下一代测序已经总体上对生物科学并且由其是医学产生了显著影响，因为测序的单位成本随着越来越快的测序机器的上市而降低。因此，在一种这样的机器中，通过首先分解为多个较小的多核苷酸片段将双链DNA分析物间接测序，所述多核苷酸片段中的每一个首先在一条链的两端腺苷酸化，从而单链第一寡核苷酸可以通过与未配对的腺嘌呤碱基杂交结合至其互补体的两端。之后对由此得到处理的片段进行尺寸选择并且捕获在涂布有结合的单链第二寡核苷酸的表面上，所述第二寡核苷酸本身是与第一寡核苷酸的序列互补体，从而实际上可以通过进一步杂交形成表面结合的双链片段的文库。在随后的聚集步骤中，之后在表面上使用延伸和等温桥连反应将这些文库成分克隆扩增数百万次以利用未使用的第二寡核苷酸。实际上，这产生了致密浓度的通过其链中的一个结合至表面的多核苷酸片段。之后移除每个片段的未结合的互补链以留下结合的单链片段准备用于测序。在测序阶段中，引发这些单链片段中的每一个，并且其互补链使用聚合酶链式反应和双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四种特征性核苷酸碱基的混合物通过延伸重新形成。每种ddNTP类型是用在不同波长发荧光的不同荧光团标记的部分末端封闭的。之后延伸反应采取三步骤循环的形式;首先相关ddNTP结合至生长链;其次，通过照射样品并且检测荧光的波长来确认其含有的核苷酸碱基以及最终移除末端封闭及其相关的荧光团以允许接下来的延伸事件发生。通过这种方式，可以逐个碱基地构建互补链的序列。将理解的是，尽管这个途径可以是高度自动化的并且可以生成高准确性的序列读取，其操作速度受延伸循环速率的限制。因此，在实践中，技术的使用倾向于包括平行加工相对短的多核苷酸片段和组装来自由其得到的各种读取的整个序列。这本身可能会导致计算的复杂性和潜在的误差引入。
[0003]最近已经做出努力，开发备选的直接测序方法。例如，WO 2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中尤其是单链或双链多核苷酸样品(例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其转运通过纳米孔基板而被读取，所述纳米孔基板设置有在纳米孔的出口内或附近并置的等离子纳米结构(plasmonic nanostructure)。在这种设备中，等离子纳米结构限定了检测窗口(基本上为电磁场)，在其中通过与入射光的相互作用以特征性的方式依次诱导每个核苷酸碱基(任选标记的)发荧光或拉曼散射光子。之后远程检测由此生成的光子，放大并且转换为数据流，其信息内容是与多核苷酸相关的核苷酸碱基序列特有的。这种序列之后可以使用在编程至与其整合的微处理器中或与其连接的辅助计算设备中的相应软件中包含的计算算法来从数据流中找回。在例如Adv.Mat.2004，16(19)pp.1685-1706中，可以发现使用等离子纳米结构及其相关的共振特征的进一步背景。
[0004]例如，在US6627067、US6267872和US6746594中描述了另一种用于快速测序多核苷酸的装置。以其最简单的形式，这种设备采用电极代替等离子纳米结构来限定整个基板中或者在纳米孔的出口中或周围的检测窗口。之后在整个电极中施加电势差并且，并且作为时间的函数测量在其之间流动的离子介质的电特征的变化，所述变化是多核苷酸和相关的电解质通过纳米孔的电泳转运的结果。在这种装置中，在各个单独的核苷酸碱基通过检测窗口时，它们连续地阻塞和开启所述检测窗，引起产生电流或电阻率的特征性波动的‘事件’。然后，利用这些波动来生成适当的数据流，用于如上所述的分析。
[0005]稳定的液滴流，尤其是微液滴流的产生，是已经具有分子生物学应用的另一个技术发展领域。例如，US7708949公开了用于在油中生成稳定水滴的新型微流体方法，而例如US2011/0250597描述了利用这种技术生成含有核酸模板(通常为多核苷酸DNA或RNA片段)和使得模板能够利用聚合酶链式反应扩增的多个引物对的微液滴。涉及所述领域的其他专利申请通常包括 JP2004/290977、JP2004/351417、US2012/0122714、US2011/0000560、US2010/01376163、US2010/0022414和US2008/0003142。
[0006]US 6277334描述了其中在通过设置有反应位点的多孔反应支持物之后将第一和第二液滴引入至反应孔中的装置，在所述反应位点处可以引起在第一和第二液滴中含有的核苷酸之间发生反应。然而，没有提到由液滴流体生成液滴流和生成来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。
[0007]US 2004/0197817涉及用于在基板上通过将含有多核苷酸的液滴沉积至基板上来制造多核苷酸阵列的装置。这种装置同样不涉及出于储存测序信息的目的而印刷包含液滴流体的液滴流和来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。
[0008]US 2010/0015614描述了用于使用微液滴聚合酶链式反应扩增接着毛细管电泳分析，基于芯片分选、扩增和表征生物材料的装置。所述装置包括平面基板，所述平面基板包括一个或多个使用含有例如来源于细菌细胞或病毒的裂解物的微液滴填充的微反应器。然而，没有教导由液滴流体生成液滴流和生成来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。
[0009]EP 1933138涉及用于通过使用液滴印刷法在其上沉积多个常规生物探针(寡核苷酸等)来制造生物测定基板阵列的方法。再一次地，没有教导由液滴流体生成液滴流和生成来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。
[0010]最近，在我们之前的申请681217772.1、681306444.9和681306445.6中，我们已经描述了新型的测序方法，其涉及逐步焦磷酸解或核酸外切多核苷酸以生成有序的核苷酸流，其可以被逐个捕获至相应的微液滴流中。之后，可以对每个液滴进行化学和/或酶操作以显示其最初含有的特定核苷酸。然而，数百万个可能通过这种方法生成的液滴的分析经常需要将液滴储存一段时间，与此同时在其中发生的各种化学和/或生物反应进行到完成。之前，出于储存目的，我们已经公开了液滴流流过的腔室，其适用于以严格顺序捕获并保持液滴。然而，尽管当所分析的多核苷酸相对短时，这种腔室是适合的，而当应用于较长的多核苷酸时，其使用变得有问题，因为大量液滴迅速导致不希望的腔室中背压的积累，进而限制了微液滴流的流动。
[0011]我们因此已经开发了备选方法，其实际上涉及在基板的表面上的离散的位置储存液滴，在那里可以将它们维持直到它们准备用于分析。因此，根据本发明，提供一种储存液滴流的方法，所述液滴的至少一些包含一个或多个单核苷酸和/或寡核苷酸以及液滴流体，其特征在于在相应的唯一位置将每个液滴依次引入至基板的表面上的步骤，并且其特征还在于通过下列过程制备所述液滴流:所述过程包括由分析物通过逐步焦磷酸解或核酸外切生成有序的核苷酸流并且将每个核苷酸捕获在相应液滴中的步骤。
[0012]在其上储存液滴的基板原则上可以由包括玻璃、聚合物、复合材料和金属在内的任何惰性材料制成。在一个实施方案中，基板是尤其是在可见光或近紫外光的频率处对电磁辐射透明的，例如玻璃或透明塑料。在另一实施方案中，其能够反射这种电磁辐射。在又一个实施方案中，基板是在液滴递送系统下方并置的具有操作表面的片材。在这种实施方案中，紧接着在液滴递送系统下方的表面可以是平面的或无轮廓的(un-profiled)或设置有如沟槽、通道、孔、凸起、凹陷、孔洞、柱和其他隆