CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性靶向vWF基因的sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及基因敲除技术领域，具体设及CRISPR-化s9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性祀向vWF基因的sgRNA。
【背景技术】
[0002] 器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近百万的 患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需要进行器官移植手 术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植手术的开展。W肾脏移植为例， 我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部分 患者死于肾衰竭。依靠死后器官捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其他 物种，W提供合适于人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。
[0003] 目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面评价，猪 成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直接将猪的器官移植到 人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪进行改造，W产生适合于人体移植 的器官，成为异种移植的终极目标。
[0004] 在进行猪肺向灵长类动物拂拂移植的过程中发现猪源的肺在移植后释放大量的 vWF(von Willebrand factor)，而人及其他灵长类动物体内的异种反应性抗体能结合vWF 的A1地a(l，3)Gal抗原决定簇并能激活灵长类的血小板。vWF是一类具有大分子量、有黏附 功能的糖蛋白，它能介导血小板的粘连从而促进伤口的止血，而vWF的缺陷将导致粘膜及皮 肤的出血症。vWF介导的蛋白-蛋白相互作用在止血过程及血栓的形成中发挥重要的调控作 用。在猪肺向拂拂移植的研究中表明，大量的异种反应性抗体能结合猪肺释放的vWF从而与 猪肺血管的内皮细胞脱离。异种反应性抗体/vWF复合体能通过识别血小板表面的Gp化受体 激活并聚集人及其他灵长类动物的血小板，从而导致急性的肺移植物失能。
[000引在猪肺的ex vivo人血灌注实验中，使用血小板GPIIb-IIIa受体括抗剂或血小板 受体GPIb/vWF相互作用抑制剂能显著性提高移植物的存活时间。而使用vWF缺陷的猪肺也 能有效地减轻猪-拂拂异种移植过程中常见的凝血病。此外，使用vWF缺陷的猪肺进行异种 移植还能显著性降低内皮细胞的激活。因而，通过基因工程技术敲除猪的vWF，有望在使用 缺陷vWF猪源器官进行异种移植时减轻异种移植器官失能的搏症，将对异种移植作出重要 贡献。实现此策略最好的途径就是构建vWF分子缺失的基因修饰猪。
[0006]目前，常见的基因敲除技术包括同源重组巧omologus Recombination,皿)技术、 类转录激活效应子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN) 技术、锋指核酸酶(Zinc-Finger Nuclease,ZFN)技术W及最近发展的规律成簇间隔短回文 重复（Clustered Regularly Interspaced 化ort Palin化omic R邱eat,CRISPR)技术。皿 技术由于重组效率低下(效率大约只有10-6)，对突变体的筛选工作非常耗时和低效，已逐渐 被取代。TALEN技术和ZFN技术的切割效率一般能达到20%，但都需要构建可W识别特定序 列的蛋白质模块，前期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱祀率，其 应用有限。
[0007] CRISPR是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合物由蛋 白质化S和CRISPR-RNA(crRNA)组成。目前该系统已发现有Ξ种类型，其中第二类化s9系统 组成简单，已被积极应用于基因工程领域。Cas9祀向切害化NA是通过两种小RNA--crRNA (CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)与祀序列互补识别的原理实现的。现 在已经将两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)，能够识别特定的基 因序列，引导化s9蛋白进行切割。在真核生物中，DNA被切断后发生非同源重组末端连接，造 成移码突变，最终导致基因功能性敲除。
[0008] 相比于上述3种技术，CRISIS技术操作简单、筛选效率高，能够实现精确的祀向切 害d。因此，通过CRISPR技术敲除vWF基因能够极大地提高vWF缺失细胞及基因工程猪的筛选 效率。但是该路径的关键技术难题是设计并制备精确祀向的sgRNA，因为基因的祀向精确度 高度依赖于sgRNA祀序列，能否成功设计出精确祀向的sgRNA成为敲除目的基因的关键技术 问题，本发明意在解决该技术问题从而为敲除vWF基因提供坚实的基础。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性 祀向vWF基因的SgRNA。
[0010] 根据本发明的第一方面，本发明提供在CRISPR-化s9特异性敲除猪vWF基因中用于 特异性祀向vWF基因的SgRNA，该SgRNA具有W下特点：
[00川 （1)该SgRNA在vWF基因上的祀序列符合5 ' -N(20)NGG-3 '的序列排列规则，其中N (20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合规则的祀序列可W位于正义链 或反义链；
[001引 （2)该SgRNA在vWF基因上的祀序列位于vWF基因的外显子编码区；
[001引（3)该SgRNA在vWF基因上的祀序列是唯一的。
[0014] 作为本发明的优选方案，上述祀序列为序列表中SEQ ID NO: 1~58中任一条序列 所示的序列。
[0015] 作为本发明的优选方案，上述祀序列为序列表中SEQ ID N0:1所示的序列。
[0016] 根据本发明的第二方面，本发明提供CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法， 该方法包括如下步骤：
[0017] (1化第一方面所述的SgRNA的祀序列的5'-端加上用于形成粘性末端的序列，合 成得到正向寡核巧酸序列;在第一方面所述的SgRNA的祀序列对应的互补序列的两端加上 合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核巧酸序列;将合成的正向寡核巧酸序 列与反向寡核巧酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核巧酸；
[0018] (2)将上述双链寡聚核巧酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体，得到携带含 相应祀序列的SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确 的阳性克隆，并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0019] (3)用上述携带有SgRNA寡聚核巧酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细胞 系包装出同时携带祀向vWF基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0020] (4)使用上述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养;然后收集被感染的目的细 胞，W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定 vWF基因的敲除情况。
[0021 ]作为本发明的优选方案，上述表达载体为序列表中SEQ ID N0:59所示序列的载 体。
[0022]作为本发明的优选方案，上述方法包括如下步骤：
[00创 （1)在第一方面所述的sgRNA的祀序列的5'-端加上CACCG序列，合成得到正向寡核 巧酸序列;在第一方面所述的sgRNA的祀序列对应的互补序列的5 ' -端加上AAAC序列、3 ' -端 加上C，合成得到反向寡核巧酸序列；将合成的正向寡核巧酸序列与反向寡核巧酸序列退 火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核巧酸；
[0024] (2)将上述双链寡聚核巧酸连入如序列表中SEQ ID N0:59所示序列的表达载体 lentiCRISPR v2经BsmB I限制性内切酶酶切得到的线性化载体，得到携带SgRNA寡聚核巧 酸的重组表达载体lentiCRISPR v2-vWF，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆，并 对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[002引 （3)用上述表达载体lentiCRISPR v2-vWF、包装质粒和包装细胞系包装出同时携 带祀向vWF基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0026] (4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养;然后收集被感染的 目的细胞，W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因片段，经过变性、复性及酶切， 确定vWF基因的敲除情况。
[0027] 作为本发明的优选方案，上述包装质粒为质粒pLPl、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG;上 述包装细胞系为HEK293T细胞。
[0028] 作为本发明的优选方案，上述目的细胞为猪PIEC细胞。
[0029] 作为本发明的优选方案，上述W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因 片段，经过变性、复性及酶切，确定vWF基因的敲除情况，具体为：