97] 反向寡核巧酸（ΙΟμΜ):化L
[0098] 10XPCR buffer:化L
[0099] dd出0:16化
[0100] 将上述反应体系放入PCR仪，并按w下程序进行反应。
[0101] 反应程序：
[0102] 95°C,5min；
[0103] 80°C，5min;
[0104] 70°C,5min；
[0105] 60°C，5min;
[0106] 50°C,5min；
[0107] 自然降至室溫。
[010引 2.构建sgRNA表达载体
[0109] (1)利用BsmB I限制性内切酶酶切目标载体lentiCRISPR v2质粒(其序列如序列 表中沈Q ID N0:59所示）。
[0110] 按照W下反应体系进行配制：
[0111] LentiCRISPR v2质粒：化邑
[0112] 10 X 酶切 buffer :2化
[0113] BsmB I限制性内切酶：2化
[0114] 补充d地2〇至总体积20化
[0115] 将酶切反应体系置于37°C反应地。
[0116] (2)电泳分离并纯化载体片段
[0117] 酶切结束后，将酶切混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，选择载体片段（约 12化)进行切割，并通过DNA凝胶回收柱进行回收。
[0118] (3)将合成的双链DNA片段与载体主片段进行连接并转化大肠杆菌
[0119] 将复性得到的双链DNA片段与回收得到的载体片段进行连接反应，按照W下反应 体系进行配制：
[0120] LentiCRISPR v2载体片段：100ng
[0121] 双链 DM 片段：200ng
[0122] T4连接酶：1化
[0123] T4 连接反应 buffer :1化
[0124] 补充d地2〇至总体积10化
[01巧]将连接混合物置于25°C反应化。
[0126] 反应结束后将连接混合物转化大肠杆菌D册α菌株：向连接混合物中加入10化L大 肠杆菌DH5a感受态细胞，冰上解育30min;将混合物放入42°C水浴，热激90s后放入冰上冷 却；向混合物加入1〇化1 LB培养基，37°C摇床培养20min;将混合物涂Amp LB平板，37°C培养 1地。
[0127] (4)鉴定正确的转化克隆
[0128] 从Amp LB平板上挑选若干菌落进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定。挑选可能 正确的克隆进行测序，验证插入序列是否正确。对于正确的lentiCRISPR V2-VWF载体克隆 进行保种。
[0129] 实施例Ξ、获得表达vWF SgRNA的假型慢病毒
[0130] 1.材料准备
[0131] 扩增并抽提包装质粒pLP 1、pLP2和pLP/VSVG (购自Invi化ogen，其图谱分别如图2、 图3和图4所示）；扩增并抽提载体质粒lentiCRISPR V2-VWF;培养包装细胞系皿K293T细胞 (购自ATCC) ;DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS (购自Gibco); Lipofectamine2000(购自Invi化ogen);皿K293T细胞培养于含5%C02的37°C培养环境中， 培养基为含10%FBS的DMEM培养基。
[0132] 2.转染和病毒包装
[0133] 第一天:将包装细胞系HEK293T传代至10cm dish,约30%融合度；
[0134] 第二天:在肥K293T达到80%融合度时按照下列配方进行转染：
[01巧]配制混合物1，包含：
[0136] lentiCRISPR v2-vWF:6yg
[0137] pLPl:化邑 [013引 pLP2:化邑
[0139] pLP/VSVG:3yg
[0140] Opti-MEM :500化。
[0141] 配制混合物2,包含：
[0142] Lipofectamine 2000:30μΙ
[0143] Opti-MEM :500化。
[0144] 静置5min后，将混合物1和混合物2混匀成转染混合物，静置20min。
[0145] 将皿K293T培养基换为无血清DMEM培养基，加入转染混合物，37°C培养化后换为 20 % FBS的DMEM培养基，继续培养。
[0146] 3.病毒收集与保存
[0147] 第Ξ天：转染4她后收集含病毒的皿K293T培养基上清，用0.45μπι滤头过滤后，分 装，放置-80°C保存。
[0148] 实施例四、感染目的细胞并检测祀序列的敲除效果
[0149] 1.材料准备
[0150] 培养目的细胞系猪髓动脉血管内皮细胞PIEC(购自中国科学院细胞库）;DMEM培养 基和胎牛血清FBS(购自Gibco);祀序列(序列1)的lentiCRISPR v2-vWF假型慢病毒;PIEC细 胞培养于含5%C02的37°C培养环境中，培养基为含10%FBS的DMEM培养基。
[0151] 2.慢病毒感染目的细胞
[0152] 第一天:将目的细胞传代至6孔板，约20%融合密度。每一种病毒需要一个6孔，同 时需要效率对照一个6孔。
[0153] 第二天:待目的细胞约40%融合密度时加入ImL lentiCRISPR v2-vWF假型慢病毒 上清及ImL DMEM培养基。效率对照不需要添加慢病毒。
[0154] 第Ξ天:感染2地后去除含病毒培养基，换成正常培养基，加入嚷岭霉素至终浓度2 yg/mL，没有感染病毒的效率对照样品也同时加入嚷岭霉素作为对照，培养4她。
[0155] 3.细胞感染效率检测和培养
[0156] 第五天:未感染的效率对照细胞在嚷岭霉素的作用下应该全部调亡(〉95%)。根据 感染慢病毒细胞的调亡情况判断细胞的感染效率，通常可W达到90% W上的感染效率(调 亡率<10%)。必要时可w将病毒上清进行浓缩或梯度稀释后进行感染w达到合适的感染效 率。
[0157]经过嚷岭霉素筛选后，未感染的细胞发生调亡。将目的细胞重新传代并换为普通 培养基培养4她。
[015引 4.检测vWF基因敲除效果
[0159] (1)设计上下游引物W扩增vWF基因片段，其中上下游引物序列如下所示：
[0160] TCTGAGCACCACATGGCTTG(SEQ ID N0：62)；
[0161] ACACCAGCTCAATCCTGATC(SEQ ID N0:63)。
[01叫 （2川欠集部分目的细胞，使用promega基因组DM试剂盒抽提基因组DNA。同时抽提 野生型目的细胞的基因组DNA。
[0163] (3) W基因组DNA为模板扩增包含祀序列的vWF基因片段(包括感染的突变样品和 野生型样品）。
[0164] 扩增反应体系（2化L)如下：
[0165] 上游引物（ΙΟμΜ)αμΙ
[0166] 下游引物（ΙΟμΜ):化L
[0167] 2XPCR Mix:10yL [016 引基因组DNA:100ng
[0169] W上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
[0170] 反应程序：
[0171] 95°C,3min
[0172] 95°C,30s
[0173] 58°C,20s
[0174] 72°C,20s
[0175] 72°C,3min；
[0176] 其中第二步至第四步重复35个循环。
[0177] (4)电泳检测PCR产物并回收纯化
[0178] (5)将纯化后的DNA片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子(包括突变样品和 野生型样品）。
[0179] 反应体系如下所示：
[0180] 基因组PCR片段：200ng
[0181] 5X反应buffe;r:2liL
[0182] 反应体系共化L
[0183] W上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
[0184] 反应程序：
[0185] 95°C，5min;
[0186] 80°C,5min；
[0187] 70°C,5min；
[018 引 60°C，5min;
[0189] 50°C,5min；
[0190] 自然降至室溫。
[0191] (6)用化uiser酶切割复性后的杂交DNA(包括突变样品和野生型样品）
[0192] 向经过变性、复性的反应混合物加入化L化uiser酶，45°C解育20min。
[0193] (7)电泳检测酶切产物，检测祀序列介导的vWF基因敲除效果。
[0194] 将经过酶切的DNA片段用2%的琼脂