[0030] (a) W感染病毒的目的细胞的基因组DNA为模板，用vWF基因的上下游引物扩增包 含上述SgRNA的祀序列的vWF基因片段，同时用相同引物扩增未感染病毒的野生型细胞的基 因组DNA;
[0031] (b)纯化上述扩增到的vWF基因片段，然后将来自感染病毒的目的细胞的vWF基因 片段与来自野生型细胞的vWF基因片段等量混合，加热变性、复性，形成杂交DNA分子；
[0032] (C)用化uiser酶切割复性后的杂交DNA分子；
[0033] (d)电泳检测酶切产物，检测祀序列介导的vWF基因敲除效果。
[0034] 根据本发明的第Ξ方面，本发明提供在CRISPR-化s9特异性敲除猪vWF基因的方法 中用到的重组表达载体lentiCRISPR v2-vWF，该重组表达载体的骨架载体的序列如序列表 中SEQ ID N0:59所示;所携带的祀序列如第一方面的SgRNA的祀序列，优选序列表中SEQ ID NO :1所示的祀序列。
[0035] 根据本发明的第四方面，本发明提供如第一方面所述的S排NA或第Ξ方面所述的 重组表达载体lentiCRISPR v2-vWF在CRISPR-化s9特异性敲除猪vWF基因的方法中的用途。
[0036] 本发明的针对CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因，成功地找到特异性祀向vWF基 因的SgRNA,将本发明的SgRNA用于CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法中，能够快速、 精确、高效、特异性地敲除猪vWF基因，有效地解决构建vWF基因敲除猪周期长和成本高的技 术问题。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例中使用的载体质粒lentiCRISPR v2的质粒图谱；
[0038] 图2为本发明实施例中使用的包装质粒pLPl的质粒图谱；
[0039] 图3为本发明实施例中使用的包装质粒PLP2的质粒图谱；
[0040] 图4为本发明实施例中使用的包装质粒pLP/VSVG的质粒图谱；
[0041] 图5为本发明实施例中酶切验证祀序列的基因敲除效果的电泳检测结果图，其中Μ 表示DNA Marker, 1表示表1中第1号祀序列对vWF基因的祀向切割效果，WT表示未经过病毒 感染和化s9切割的野生型细胞的PCR产物化uiser酶切检测结果，箭头处表示经化uiser酶 切割得到的小片段。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。运些附图和具体 实施例不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0043] W下实施例中设及的试验材料和试剂：lentiCRISPR v2质粒购自Addgene公司，包 装质粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG购自Invitrogen公司，包装细胞系肥K293T细胞购自美国模式 培养物集存库(ATCC)，PIEC细胞购自中国科学院细胞库，DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎 牛血清FBS购自Gibco公司，Lipofectamine 2000购自 Invitrogen公司。
[0044] W下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第Ξ版)J.萨姆布鲁克一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 [004引本发明的概括性的技术方案包括W下五个部分：
[0046] 一、Sus scrofa(猪)vWF基因 sgRNA勒1序列的选择和设计
[0047] l.vWF基因的SgRNA祀序列选择：
[0048] 在vWF基因外显子区寻找合适的20bp寡核巧酸序列作为祀序列。
[0049] 2. vWF基因的SgRNA祀序列设计：
[0050] 将上述祀序列及互补序列分别添加接头，形成正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸 序列。
[0051 ] 二、构建vWF基因的CRISPR载体
[0052] 1.合成上述正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸序列，复性形成具有粘性末端的双 链DNA片段(即双链祀序列寡聚核巧酸，也可W称为双链寡聚核巧酸）。
[0053] 2.构建 CRISPR-sgRNA 表达载体：
[0054] 将上述双链DNA片段构建至目标载体（如lentiCRISPR v2,其质粒图谱如图1所 示），形成如lentiCRISPR v2-vWF的慢病毒CRISPR载体。
[005引 Ξ、获得表达vWF SgRNA的假型慢病毒
[0056]利用包装质粒、包装细胞系与慢病毒CRISPR载体生产表达vWF SgRNA的CRISPR假 型慢病毒。
[0057] 四、感染目的细胞并检测vWF基因敲除效果
[0058] 1.慢病毒感染目的细胞：
[0059] 将如lentiCRISPR v2-vWF的假型慢病毒加入目的细胞培养基进行感染并进一步 培养。
[0060] 2.检测vWF基因敲除效果：
[0061] 收集目的细胞，W基因组DNA为模板扩增包含祀序列的基因片段，经过变性、复性 及酶切，确定vWF基因的敲除情况。
[0062] 五、vWF基因敲除单克隆的挑选和鉴定
[0063] 1.对于有确定敲除效果的目的细胞群，通过稀释和单克隆培养，分离出若干单细 胞来源的细胞株。
[0064] 2.鉴定单克隆的vWF敲除情况。
[0065] W下通过实施例详细说明本发明的技术方案及其有益效果。
[0066] 实施例一、Sus scrofa(猪)vWF基因 sgRNA祀序列的选择和设计
[0067] 祀序列决定了SgRNA的祀向特异性和诱导化s9切割目的基因的效率。因此，高效特 异的祀序列选择和设计是构建SgRNA表达载体的前提。
[006引 l.vWF基因的SgRNA祀序列选择
[0069] 针对vWF基因，在祀序列选择上应该遵循下列原则：
[0070] (1)在vWF基因外显子编码区寻找符合5'-N(20)NGG-3'规则的祀序列，其中N(20) 表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合规则的祀序列可W位于正义链或反 义链；
[0071] (2)选择外显子编码区序列，运样的编码区序列的切割会造成vWF基因的功能敲 除，残留截短的序列不会形成有功能的蛋白；
[0072] (3)如果存在多种剪切体，则在共有外显子编码区进行选择，针对vWF基因选择靠 近N端的外显子编码区序列即可满足该条件；
[0073] (4)利用在线序列分析工具化《9:/八1'1391'.1]1；[1:.6(111/)分析^上祀序列在猪基因 组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的祀序列，根据评分进一步挑选，所挑选的祀序列 在vWF基因上是唯一的。
[0074]基于W上原则，选择出表1所示的祀序列集合。
[007引表1祀序列集合 [0076]
[0079] 2.vWF基因的sgRNA祀序列设计：
[0080] (l)WlentiCRISPR v2质粒作为表达载体，根据lentiCRISPR v2质粒的特点，在上 述N(20)祀序列的5'-端添加 CACCG序列，形成正向寡核巧酸序列：
[0081 ] 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'；
[0082] (2)在上述N(20)祀序列的反向互补序列的两端添加序列，形成反向寡核巧酸序 列：
[0083] 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'；
[0084] 正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸序列可W互补形成具有粘性末端的双链DNA片 段：
[0085 ] 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
[0086] 3'-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'〇
[0087] 实施例二、构建vWF基因的SgRNA表达载体 [008引1.合成DNA插入片段
[0089] (1)合成上述设计的正向和反向寡核巧酸序列
[0090] 寡核巧酸序列可W由商业化的公司（如Invi化ogen公司）根据提供的序列具体合 成。本实施例及W下实施例研究了表1中所列的第1号序列所示的祀序列对vWF基因的敲除 效果。
[0091] 第1号祀序列对应的正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸序列如下：
[0092] GACCGGCCCCGCGGGCATGGAGTAC(沈Q ID N0:60);
[0093] AAACGTACTCCATGCCCGCGGGGCC(SEQ ID N0:61)。
[0094] 将对应的正向和反向寡核巧酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链DNA片 段。
[009引反应体系（2化L)如下所示：
[0096] 正向寡核巧酸（ΙΟμΜ):化L
[00